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脊髓损伤是一种致残率高、愈后差的疾病，患者多伴有终身残疾。近年来我国脊髓损伤的发病率呈明显逐年递增趋势，每年新增脊髓损伤患者超过6万人，但是临床上针对脊髓损伤病人却缺乏有效的治疗手段。长期以来人们一直认为脊髓损伤后神经纤维是不能再生的，但是近来的研究结果表明，只要克服中枢神经系统不利轴突生长的微环境，损伤后脊髓中的神经纤维是可以再生的。目前对脊髓损伤修复的关键分子及机制仍然不清楚，因此探索与脊髓损伤修复相关的新分子及其作用机制，对今后脊髓损伤的治疗至关重要。miRNA是一类长度为22个核苷酸左右非编码的微小单链RNA，它通过多种机制调控靶mRNA的表达。人体内约有1000个miRNA，调控超过1/3的编码基因，影响着几乎所有的信号通路。现有的研究结果表明：多种miRNA在中枢神经系统广泛表达，它们在中枢神经系统发育和功能维持上扮演着非常重要的角色。一些miRNA在脑缺血、创伤性脑病、脊髓损伤、阿尔茨海默病、亨廷顿氏病、帕金森病等中枢神经系统疾病中出现表达上调或下调，提示这些miRNA可能在上述疾病的病理生理过程中发挥作用。本课题采用Agilent Mouse miRNA基因芯片，检测了正常C57BL/6小鼠以及脊髓重度夹伤后1d、3d、7d、14d、21d、28d时脊髓组织中miRNA表达谱的变化。miRNA基因芯片结果显示：有11个miRNA在脊髓损伤后与对照组相比出现差异性表达，其中miR-21在损伤后3d、7d、14d表达上调；miR-142-3p和miR-223在损伤后3d、7d表达上调；miR-146a在损伤后14d、21d、28d表达上调；miR-199b在损伤后7d表达上调；而miR-1在损伤后7d、14d、21d、28d表达下调；miR-133a和miR-133b在损伤后21d、28d表达下调；miR-150和miR-486在损伤后7d表达下调。随后我们运用qRT-PCR技术对这些miRNA在脊髓损伤后的表达情况进行了验证，检测结果与基因芯片的结果一致。出乎我们预期的是中枢神经系统表达最丰富的miR-124在脊髓损伤前后并未发现有明显的表达上调或下调，我们推测有可能和我们在送检芯片时选取的脊髓长度有关。我们用原位杂交的方法进行了miR-124全脑切片和脊髓的染色，发现miR-124在小鼠的嗅球、海马、大脑皮层、小脑脚、脊髓灰质等神经元聚集区有着大量的表达。我们取脊髓夹伤后1d、3d、7d的损伤段脊髓（长度为0.8cm）进行总RNA的提取，通过qRT-PCR对miR-124的表达水平进行了检测，发现miR-124在损伤后1d、3d、7d均出现显著性的表达下调。随后我们对脊髓损伤后7d的切片进行了miR-124原位杂交和NeuN免疫组化的双标记，结果显示：损伤中心区域，无NeuN和miR124的表达；损伤中心的周边区域，可以见到只表达NeuN，而无miR-124表达的神经元；正常的脊髓神经元则呈NeuN和miR-124双标记。该结果表明miR-124和神经元的损伤状态密切相关，提示我们miR-124可能参与了脊髓神经元功能可塑性的调节，可能在脊髓损伤修复的过程中发挥作用。通过生物信息学网站的检索，我们发现miR-124可能调控的靶基因近千个，与中枢神经系统密切相关的靶基因就达近百个，如果我们对这些靶基因逐一进行验证，那工作量无疑将是巨大的。因此，采用遗传学手段，去除miR-124基因的功能，无疑是一个非常有效的研究手段。目前miRNA基因功能缺失的研究中主要采用三种方法：基因敲除、反义寡核苷酸抑制剂和miRNA海绵，基因敲除无疑是研究一个基因功能最好的手段，但由于编码miR-124的基因位于3个不同染色体上，因此敲除掉miR-124将异常困难；通过局部注射miR-124的反义寡核苷酸抑制剂仅仅能产生瞬时抑制的作用，并不适合脊髓损伤这样一个慢性疾病的研究。因此我们选择了miRNA海绵的方法去敲低（knock-down）miR-124的功能。miRNA海绵载体上一般包含7-10个与目的miRNA反向互补的重复序列，它可以与体内成熟的miRNA互补结合从而抑制miRNA的功能。首先，我们合成了带有miR-1247个反向互补序列的质粒，随后将这段序列亚克隆到pEGFP-C3和pMIR-report两种报告基因载体上，构建好的海绵载体分别命名为pEGFP-miR-124sp和pMIR-miR-124sp。通过酶切验证、测序等方法，对重组质粒进行鉴定。pEGFP-miR-124sp载体上带有绿色荧光蛋白报告基因，而pMIR-miR-124sp载体上带有荧光素酶报告基因。我们利用这两种检测系统各自的特点，在培养的COS-7细胞系中去验证miR-124海绵转染后抑制miR-124的特异性和有效性。当我们把miR-124mimic（miR-124的人工合成物）与报告基因载体pMIR-miR-124sp共转染时发现，COS-7细胞中荧火虫荧光素酶的活性与对照组相比出现了显著性的下调，荧光素酶的活性被抑制了90%。而挽救实验证实当我们把pEGFP-miR-124sp、pMIR-miR-124sp与miR-124mimic共转染时，萤火虫荧光素酶的表达则基本不受影响。当我们把miR-124mimic与pEGFP-miR-124sp荧光海绵载体共转染COS-7细胞后，在显微镜下观察时发现，COS-7细胞中绿色荧光蛋白的表达强度较对照组出现了明显的降低；同时流式细胞检测结果也显示表达绿色荧光蛋白的细胞数量明显减少。我们用两种实验方案都得到了相似的实验结果，这强烈的提示我们miR-124海绵确实可以在COS-7细胞中将转染进的miR-124“吸附”掉，从而在细胞内发挥Knock-down miR-124的作用。进而，我们构建了高表达miR-124前体的载体pCIG-miR-124，将构建好的载体和空载体pCIG转染Hela细胞后，两者均可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达，经过qPCR定量后发现转染pCIG-miR-124的Hela细胞较转染pCIG的Hela细胞内miR-124的表达量显著的升高，说明pCIG-miR-124能成功表达成熟的miR-124。然后，我们采用小鼠受精卵显微注射的转基因方法，利用抑制miR-124表达的pEGFP-miR-124sp海绵载体和高表达miR-124的pCIG-miR-124载体，获得了9只EGFP表达阳性的miR-124low转基因小鼠和6只EGFP表达阳性的miR-124high转基因小鼠，并分别在小鼠脊髓切片上观察到了低表达EGFP和高表达EGFP的荧光信号，初步说明了这两种转基因小鼠构建成功。我们期望通过建立可以使外源基因稳定遗传下去的小鼠品系，为进一步阐明脊髓损伤后miR-124的功能及分子机制奠定基础。