基因沉默(Genesilencing)是生物尤其是高等生物适应环境，抵抗外来病原物侵染的一种防御机制。基因沉默广泛地存在于植物、动物和真菌当中，并且这种现象分别被称为共抑制(Cosuppression)、RNAi(RNAinterference)和Quelling。根据已有的研究，不同生物中的基因沉默具有类似的作用机制以及相似功能的因子，即Dicer将dsRNA在ATP存在的情况下切割成21-25nt的siRNA，这样的siRNA与RISC结合并将之激活形成复合体，这一复合体可以与序列互补的mRNA配对并将后者切割、降解，从而抑制了相应基因的表达。 基因沉默的发现和研究时间并不长，但它调控基因表达的机制已经成为近年来的研究热点，人们从动物、植物和病毒中分离到了基因沉默的关键因子Dicer、RISC、RdRP以及抑制因子HC-pro等。因此，基因沉默这一在不同物种中存在的保守机制的神秘面纱逐渐揭示在人们面前。同时，一些利用基因沉默研究基因功能的方法也纷纷建立起来，其中较为突出的一种就是病毒介导的基因沉默(Virus-inducedgenesilencing,VIGS)。VIGS是利用病毒将外源基因导入植物体内并抑制内源基因表达的方法。由于具有快速、高效、可靠、稳定和简便等优点，VIGS已被用于个别基因和大规模基因功能的研究。 本文利用VIGS方法在本塞姆氏烟草中进行了大规模基因功能的筛选和研究。我们以TRV(Tobacclrattlevirus)为基础构建了新的VIGS载体，pYY13。在这个载体中我们采用了LIC(Ligation-independentcloning)的方法进行基因克隆，使得大规模基因克隆变得高效、快速和准确。我们将分属三个基因家族的400个番茄EST克隆到pYY13中并在本塞姆氏烟草中进行了基因沉默的筛选，结果发现有21个样品的植株在受侵染后表现出明显的变异表型。进一步，我们利用本塞姆氏烟草的序列重复了实验，16个样品表现出严重的表型，5个样品的表型减弱。这些表型涉及植物发育的各个方面，例如，花器官变异、矮化、多分枝、不育、叶子形态变异和叶片颜色变化等.通过统计，我们发现新载体pYY13克隆的成功率达到98％，而且非常稳定，所有出现表型的样品在所检测的植物中都表现出一致的表型。 在所得到的基因沉默后表型异常的植物中，我们重点研究了两个基因的功能。一个是与花器官形成有关的基因，NbMADS4/SEP。根据已有的报道，该基因是控制花器官形成的关键基因。通过对这一基因的研究，一方面我们希望鉴定该基因在本塞姆氏烟草中是否具有拟南芥SEP基因类似的功能及是否具有新的功能：另一方面，由于该基因的功能在其他物种中已有较好的研究，因此，我们可以利用针对该基因的基因沉默来验证我们新构建的VIGS系统的可靠性，从而为进一步研究其他基因的功能提供依据。实验发现，NbMADS4/SEP基因沉默后植物的花发育异常：花萼增大了2-3倍、花柄变粗变长、花瓣和雄蕊转变成叶子样的结构、心皮被另一朵变异的花或花序取代。我们在本塞姆氏烟草中克隆到了两个相关的基因，通过序列比对和保守结构域及位点的分析，我们发现这两个基因属于MADS-box基因，它们编码的蛋白质与拟南芥的SEP有很高的同源性(＞55％)。为了确定这两个基因的功能，我们分析了它们在不同组织中的表达，发现它们只在花器官中表达，而在营养生长的器官中不表达，这说明这两个基因的确与花器官的发育相关。另外，我们对这两个基因的功能特异性进行了分析，发现这两个基因在植物体内都具有功能而且功能冗余。进一步，我们利用激光扫描共焦显微镜对VIGS后的植物花器官进行了观察，发现变异的花器官与已报道的拟南芥突变体seplsep2sep3sep4非常相似，花瓣和雄蕊变成叶子状的结构，而且花瓣为绿色，上面还有少量的气孔。根据我们得到的实验证据，我们认为这两个基因就是SEP基因在本塞姆氏烟草中的同源基因，它们是控制花器官形成的关键基因同时与叶子向花的转变有关。我们把这两个基因命名为NbMADS4-1/SEP1和NbMADS4-2/SEP2。 另一个基因是βNAC/BTF3基因，这个基因沉默后植物表现出严重的变异特征，如矮化、叶片形状不规则、叶片颜色变化和花发育异常。我们从本塞姆氏烟草中克隆到了两个βNAC/BTF3基因，分别命名为NbβNAC1/BTF3-1，和NbβNAC2/BTF3-2基因。根据蛋白质序列比对发现这两个蛋白与人、鼠、果蝇及线虫中的BTF3基因有很高的同源性。 为了分析这两个基因在植物体内执行的功能，我们检测了它们功能的特异性及在不同组织中的表达情况，结果发现它们的功能是冗余的而且在所检测的植物组织中都有稳定的表达。这说明这两个基因对于植物的正常生长具有重要作用而且其功能是多方面的。 为了分析NbβNAC/BTF3基因受到抑制后植物在细胞水平的变化，我们分别用扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)和激光扫描共焦显微镜(ConfocalMicroscopy)等方法对对植物叶片进行了仔细观察，发现基因沉默后的植物叶片上的气孔大量增加，特别是有两个以上的气孔彼此接触，打破了单细胞间隔的规则，这在野生型植物中是没有的。这一现象与突变体tmm、flp、sdd1和yoda非常相似，这些基因都是控制气孔形成的重要基因。因此我们推测NbβNAC/BTF3基因的功能可能与气孔形成有关。为了证实这一点，我们构建了βNAC/BTF3基因的过量表达载体并进行了功能互补的实验，结果VIGS之后再过量表达βNAC/BTF3基因使得气孔的数量减少了。另外，我们也发现基因沉默后植物的细胞核和叶绿体发生了变化，这可能是产生变异表型的原因。通过大量的实验证据，我们认为NbβNAC/BTF3基因是控制植物发育，尤其是气孔形成的重要基因。同时，这也是首个针对植物βNAC/BTF3基因功能的研究。