山地麻蜥Sox与Dmrt基因保守区的克隆研究及其睾丸组织cDNA文库的初步构建

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Sox与Dmrt基因家族是参与生物个体发育的两个基因家族,在进化上高度保守。Sox家族成员的典型特征是编码的蛋白质都具有一个保守的基序HMG-box,可以与DNA序列(5’-(A/T)(A/T)CAA(A/T)G-3’)特异性结合,促进基因的特异转录,从而在胚胎发育及性别分化中起着重要的调控作用;而Dmrt基因家族是一个与性别决定相关的基因家族,该家族成员都含有一个具有DNA结合能力的保守基序―DM结构域,以锌指结构与特异DNA序列结合,在性别决定和分化发育的调控中担负着重要的功能。  为了研究山地麻蜥(Eremias breuchleyi)的Sox基因和Dmrt基因,本文采用简并PCR技术,分别对山地麻蜥Sox基因的保守序列和Dmrt基因的DM结构域进行了扩增、克隆和序列分析。经SSCP技术筛选,结果在山地麻蜥的雌雄个体中筛选出7个Sox基因家族成员,且无性别差异,与GenBank联机分析,发现其与人类相应SOX蛋白氨基酸序列的一致性分别为96%,88%,94%,99%,96%,98%,97%,按通用命名法,根据山地麻蜥的拉丁名Eremias breuchleyi,分别命名为EbSox2,EbSox3,EbSox4,EbSox11,EbSox12,EbSox14,EbSox21;同样,通过SSCP技术筛选和测序,得到了5个具有不同DM序列的Dmrt基因克隆,分别命名为EbDmrt1a,EbDmrt1b,EbDmrt3,EbDmrt4,EbDmrt5。本研究结果显示,在山地麻蜥基因组中存在着Sox和Dmrt基因家族的多个成员,与其他动物相关的Sox和Dmrt基因进行聚类分析,显示这两个基因家族在动物系统进化上具有高度的保守性。  为了进一步探索山地麻蜥的性别决定分子机制,获得相关基因的全长cDNA序列,本研究运用SMART(switching mechanism at5’ end of RNAtranscript)技术,初步构建了山地麻蜥睾丸组织cDNA文库。琼脂糖凝胶电泳结果表明,文库所含全长cDNA的长度主要集中在500~2000bp之间,说明该文库符合建库的要求;将双链cDNA通过T/A克隆、随机挑选阳性克隆并测序后,得到一条592bp的全长cDNA序列,该基因全长cDNA序列中有162bp(编码53个氨基酸)的ORF(open reading frame),5’端非翻译区158bp,3’端非翻译区272bp,另外在cDNA540bp处有一个加Ploy(A)的信号序列。该文库为进一步构建高质量的cDNA文库,筛选、克隆性别决定基因全长cDNA序列奠定了基础。
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