论文部分内容阅读
扩展青霉脂肪酶(PEL)是一类特殊的酯键水解酶,可在油水界面催化甘油三酯生成脂肪酸和甘油,在工业上起着重要的作用。本研究将扩展青霉脂肪酶基因(lip07)导入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子来表达PEL。巴斯德毕赤酵母是一种理想的真核蛋白表达系统,能够稳定高效表达外源蛋白。利用GAP启动子,无需像AOX1启动子那样,在诱导表达阶段需要剔除非甲醇的碳源,且不以甲醇为诱导物,避免了有毒物质的积累。以葡萄糖或甘油为碳源,重组脂肪酶(PEL-pGAPZA-lip07)均得到了表达。通过优化发酵条件,酶活从开始的53.0U/ml提高到了221.5U/ml。本研究还利用定点突变技术对PEL进行了分子突变,共获得了9株脂肪酶突变体。其中PEL-ep8-K202A热稳定性得到很大改善,Tm值比野生型提高了2.63℃,并具备与野生型相当的脂肪酶表达量。一:PEL基因在巴斯德毕赤酵母中的表达将编码扩展青霉脂肪酶的cDNA(lip07)克隆到酵母表达质粒pGAPZA,利用Zeocin抗性及限制性酶切鉴定筛选重组表达载体pGAPZA-lip07,然后电转化宿主菌毕赤酵母GS115,以GAP为启动子进行胞外表达。橄榄油鉴定板检验表明重组菌的发酵上清具有脂肪酶活性,SDS-PAGE分析得出重组脂肪酶的分子量约为28KD,与野生型扩展青霉脂肪酶一致,发酵上清液中脂肪酶的含量约占分泌蛋白的95%以上。通过优化发酵条件,结果表明,以甘油作为碳源发酵表达PEL时表达量最高,以橄榄油为底物进行酶活测定,96小时发酵上清的脂肪酶酶活可达到221.5U/ml。二:PEL基因的定点突变为提高扩展青霉脂肪酶的热稳定性,本论文采用重叠延伸PCR的方法对PEL基因进行了多个定点突变,包括在野生型lip07上的单点突变和在随机突变体ep8(为本课题组构建的热稳定性提高的突变脂肪酶)上的叠加突变。将突变后的PEL基因连接到毕赤酵母表达载体上,并转化进入毕赤酵母GS115构建突变脂肪酶基因工程菌。在甲醇的诱导下进行突变脂肪酶的表达并测定其对温度的敏感性。(1)K202A单点突变及叠加突变叠加突变体PEL-ep8-K202A的最适作用温度比野生酶上移了2.0℃,热稳定性(Tm)比野生型提高2.63℃,比随机突变体PEL-ep8提高了1.21℃。表达量约为260.0μg/ml,发酵酶活约为504.7U/ml,比活力约为1941.0U/mg;单点突变体PEL-lip07-K202A最适作用温度不变,热稳定性(Tm)比野生型降低1.95℃,表达量约为125.0μg/ml,发酵酶活约为273.0U/ml,比活力约为2184.0U/mg。(2)N73T叠加突变叠加突变体PEL-ep8-N73T最适作用温度比野生型PEL-lip07降低5℃,热稳定性(Tm)降低0.55℃,表达量约为40.0μg/ml,发酵酶活约为71.0U/ml,比活力约为1775.0U/mg。(3)S153P、Q176P单点突变单点突变体PEL-lip07-Q176P和PEL-lip07-S153P的热稳定性均下降,Tm值分别为37.81℃和36.36℃,分别比野生型下降了1.22℃和2.67℃。(4)K202E、S91K、H107R、N157Y单点突变单点突变体PEL-lip07-K202E、PEL-lip07-S91K、PEL-lip07-H107R及PEL-lip07-N157Y均不能够在YPOM板上形成透明圈,SDS-PAGE分析亦无脂肪酶目的蛋白,突变体发酵上清不具备脂肪酶活性。