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细胞凋亡又称为细胞程序性死亡,是正常组织发育和疾病发生中的重要生物过程。研发新的细胞凋亡检测技术一直是活跃的科研领域之一。Annexin V是一种36 k Da的磷脂结合蛋白,其能够在较高浓度的Ca 2+存在下与带负电荷的磷脂如磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）结合。在正常细胞中,PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧。而当细胞凋亡发生时,即使在早期,PS也会从细胞质膜内叶外翻到细胞表面。因此,Annexin V常被作为细胞凋亡早期事件的标志物应用于多种凋亡检测技术中。尽管多种荧光标记的Annexin V探针已被应用于体外检测早期细胞凋亡的发生,但荧光探针本身需要激发光,还会产生光毒性且容易受生物样品自体发光的干扰从而产生额外的背景。这些荧光探针并不适合在活体水平深部组织研究中应用。我们提出了一种新的基于生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer,BRET）的Annexin V探针,可同时对细胞凋亡进行荧光和生物发光的检测。新传感器的双信号功能使其既可以应用于常规的基于荧光的体外细胞凋亡检测,又可用于基于生物发光的动物活体成像,以进行体内凋亡细胞的追踪。由于生物发光信号具有高灵敏度和几乎零的背景,该生物传感器可直接实现在体水平评估疾病引起的细胞凋亡及恢复过程。首先,我们依据BRET的原理,构建了包含Annexin V、绿色荧光蛋白m Neon Green和荧光素酶te Luc的融合探针质粒（Annexin V Probe,An VPb）和包含带有四个突变位点（E72Q/D144N/E228Q/D303N）的突变型Annexin V、绿色荧光蛋白m Neon Green和荧光素（te Luc）的融合探针质粒（mutant Annexin V Probe,m An VPb）,分别在大肠杆菌中表达,并用Ni-NTA进行亲和纯化得到两种融合探针蛋白。随后,我们对构建的An VPb及其对照探针m An VPb在特定范围内的激发光谱和发射光谱进行测定。同时,我们选择了文献中报道te Luc的最适底物diphenylterazine（DTZ）,并测定An VPb/m An VPb-DTZ配对的生物发光强度。结果如我们所预料的,探针的发射光谱发生了红移,在517nm处的生物发光光谱达到峰值。我们在350-650nm范围内表征了An VPb和m An VPb的光谱特性,并验证了这些探针生物发光强度对浓度的良好线性依赖性。至此,我们得到了理想的Annexin V探针及其对照探针,可以用于后续体外和体内水平的细胞凋亡检测。接下来,我们用200μΜH2O2处理12小时建立了神经胶质细胞（A172 cells）氧化应激损伤模型,在体外诱导细胞凋亡的产生。然后,分别用构建好的An VPb、m An VPb和商业化的线粒体超氧化物红色荧光探针或Annexin V-Alexa Fluor 647-碘化丙啶细胞凋亡检测试剂盒共染H2O2处理后的细胞。荧光显微镜镜检结果显示:在相同氧化应激刺激水平下,An VPb可以与PS结合,实现对早期凋亡细胞的检测,而m An VPb则不能。在细胞水平证明了Annexin V探针的检测能力后,我们进一步构建了体内模型——小鼠急性肾损伤（AKI）模型,利用探针对凋亡细胞的靶向结合能力和小动物活体成像技术,在活体水平评估AKI模型中细胞的凋亡情况进而跟踪病灶的发展。小鼠活体成像结果证明了探针的发光强度足以穿透哺乳动物组织,实现活体水平病灶的可视化。接着,我们还构建了小鼠脑卒中模型,同样在活体水平评估颅骨下的病灶区细胞凋亡情况以及追踪不同时程病灶演变过程。通过Image J计算不同时程的病灶成像灰度,我们发现在脑卒中的急性期,病灶区凋亡程度逐渐加重,后逐渐减轻,到第5天时,病灶区的凋亡已基本结束。这一结果再次证明An VPb可以在活体水平对疾病模型进行有效评估。我们进一步用这套方法评估了实验室之前其他项目筛选出来的对脑卒中具有神经保护作用的小鼠蛋白Serpina3n及其人源SERPINA3的干预效果,并与核磁共振成像（Magnetic resonance imaging,MRI）的评估方法进行了对比。结果显示Serpina3n或SERPINA3干预组小鼠的病灶面积（核磁共振成像）和细胞凋亡情况（基于An VPb的小动物活体成像）较对照组的病灶有显著缩小和减弱。综上所述,为了开发检测细胞凋亡的生物发光探针并用于在活体水平对疾病模型中的凋亡情况进行评估的新技术,我们将Annexin V与一种基于BRET的m Neon Green-te Luc融合蛋白结合起来,构建出An VPb这种高灵敏、低背景的凋亡生物传感器。An VPb不仅在细胞水平为检测早期细胞凋亡的发生提供了一种简单、快速的方法,还为在活体水平跟踪细胞凋亡和病灶演变提供了一种便捷、可靠的手段。这一方法的成功构建可为动态监控疾病的发展以及活体药物筛选和评估提供帮助。