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研究背景:全球及我国范围内,肺癌位居因癌症导致死亡排名的首位,可以分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)两大类。NSCLC又可以根据不同的组织学类型进行分类,包括腺癌、鳞癌、神经内分泌癌、腺鳞癌、肉瘤样癌等。亮氨酸拉链假定肿瘤抑制基因1(leucine zipper putative tumor suppressor 1,LZTS1)位于8号染色体短臂(8p)21.3附近,能够编码一个67kd的亮氨酸拉链蛋白,亮氨酸拉链蛋白是富含亮氨酸重复序列超家族之一,且该蛋白大部分位于细胞质,少部分位于细胞核内。多项研究表明LZTS1基因普遍表达于多种正常组织,并且LZTS1基因在许多种类肿瘤的发生发展过程中有一定的抑癌作用,这些肿瘤包括前列腺癌、肺癌、胃癌、头颈癌、乳腺癌等。有文献报道103例肺癌中有27例LZTS1基因表达缺失,43例LZTS1基因表达减少,同时结果表明LZTS1基因表达水平与肿瘤的分级呈正相关。因此LZTS1基因在肺癌的发生发展过程中起重要作用,但是其作为抑癌基因的失活机制尚未研究清楚。传统观点将抑癌基因的失活归因为基因突变、染色体缺失等,但DNA的异常甲基化为LZTS1基因的失活提供了另一种可能的解释。因此本实验将检测LZTS1蛋白及其基因在肺癌组织中的表达水平,同时比较肺癌组织与血浆循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)中LZTS1基因表达状态的一致性,分析同一肺癌组织样本中LZTS1蛋白与基因表达水平之间的关系,阐述LZTS1基因在肺癌发生发展过程中的作用,并检测LZTS1基因编码区是否存在突变以及LZTS1基因启动子区甲基化状态。第一部分LZTS1蛋白在肺癌组织中的表达研究方法:选取60例手术切除的肺癌组织标本,且术后常规病理证实为肺癌,应用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测LZTS1蛋白在肺癌组织中的表达水平,并同时分析肺癌组织LZTS1蛋白表达与临床病理特征间的关系。研究结果:1.LZTS1蛋白在原发性肺癌组织中表达发生改变,60例肺癌组织中LZTS1蛋白表达缺失和/或下降率为65%(39/60)。2.TNM分期越晚、吸烟指数越高,LZTS1蛋白表达缺失和/或下降的比率越高。3.LZTS1蛋白表达下降和/或缺失与肺癌的进展有关,可能会导致肿瘤细胞更容易发生转移。第二部分LZTS1基因在肺癌组织、正常肺组织以及ctDNA中的表达研究方法:选取50例肺癌手术病例(其中23例与第一部分中检测LZTS1蛋白表达样本为同一病例),提取肺癌组织、正常肺组织中的总RNA,应用反转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)法检测 LZTS1 基因在肺癌组织、正常肺组织中的表达,同时提取血浆中DNA,应用PCR法检测血浆ctDNA中LZTS1基因的表达,比较肺癌组织和血浆ctDNA中LZTS1基因表达的一致性,分析肺癌组织LZTS1基因表达水平与临床病理特征间的关系,并对同一肺癌组织样本LZTS1基因与LZTS1蛋白表达水平间的关系进行分析。研究结果:1.LZTS1基因在原发性肺癌组织中表达发生改变,50例肺癌组织中LZTS1基因表达下降(+/-)16例(16/50,32%),表达缺失(-)16例(16/50,32%),表达正常(+)18 例(18/50,36%)。2.吸烟指数越高,肺癌组织LZTS1基因表达缺失或/和下降的发生率越高。3.肺癌组织与血浆ctDNA中LZTS1基因表达状态二者间有较好的一致性(p=0.000,Kappa 值=0.791,p<0.05 且 0.791>0.75)。4.肺癌组织LZTS1基因与LZTS1蛋白表达情况二者间具有较显著的相关性。第三部分LZTS1基因编码区检测研究方法:在LZTS1基因表达正常但LZTS1蛋白表达下降的2例和表达缺失的3例样本中各选取1例,提取样本肺癌组织中的DNA,设计引物后对其进行PCR扩增,对扩增产物进行测序,分析LZTS1基因编码区是否存在基因突变。研究结果:1.LZTS1基因编码区922号碱基位点C→T突变,突变后该位点编码氨基酸不发生改变,该突变为同义突变。2.LZTS1基因编码区1168号碱基位点G→A突变,突变后该位点编码氨基酸不发生改变,该突变为同义突变。3.LZTS1基因编码区1949号碱基位点G→A突变可以导致该位点编码氨基酸的改变,该突变为错义突变。第四部分LZTS1基因启动子区甲基化检测研究方法:提取6例肺癌细胞系的基因组DNA,用重亚硫酸盐处理,然后用MSP法扩增基因组DNA,2%琼脂糖凝胶电泳,回收凝胶电泳PCR产物后连接T载体、转染及鉴定后应用直接测序法检测LZTS1基因启动子区甲基化状态。研究结果:1.肺癌细胞系中不同肿瘤来源的细胞系LZTS1基因启动子区甲基化程度不一致。2.肺癌细胞系中LZTS1基因启动子区甲基化程度高,平均甲基化频率为66.67%。结论:1.LZTS1蛋白及基因在原发性肺癌组织中表达发生改变。2.LZTS1蛋白表达下降和/或缺失与肺癌的进展有关,可能导致肿瘤细胞更容易发生转移。3.肺癌组织与血浆ctDNA中LZTS1基因表达状态二者间有较好的一致性(p=0.000,Kappa值=0.791,p<0.05且0.791>0.75)。4.肺癌组织LZTS1基因与LZTS1蛋白表达情况二者间具有较显著的相关性。5.LZTS1基因编码区1949号碱基位点G→A突变可以导致该位点编码氨基酸的改变。6.肺癌细胞系中LZTS1基因启动子区甲基化程度高,平均甲基化频率为66.67%。