慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)占成人白血病的15％，中位发病年龄为67岁，但可以发生于各个年龄阶段。我国CML的发病年龄较低，中位发病年龄为45岁～50岁。CML发病的分子机制是t(9，22)(q34，q11)染色体易位，即费城(ph)染色体，为本病的典型特征。9号染色体长臂3区4带的原癌基因c-abll易位到22号染色体长臂1区1带的断裂点集中簇bcr，形成bcr-abll融合基因。该基因的编码产物为p210BCR-ABL1蛋白，具有持续酪氨酸激酶活性，激活细胞内多种信号转导通路，在CML的发生发展中具有重要作用。CML分慢性期(CP-CML)、加速期(AP-CML)及急变期(BP-CML)，CP-CML的自然病程为3年-5年，未经治疗的CP-CML最终进展至加速期或急变期。酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)大大改善了CP-CML患者的疗效，目前已成为CP-CML的标准一线治疗方案，但仍有15％-20％的CML患者会出现原发和继发TKIs耐药而发生疾病的急性转化。阐明CML急性转化的分子机制、寻找预示CML急性转化的分子标志对指导制定合理治疗方案、开发新的靶向治疗药物防止疾病急性转化具有重要的意义。遗憾的是，尽管在这方面做了很多工作，目前对CML急性转化的分子学机制仍不清楚，研究CML急性转化的分子机制、寻找预示CML急性转化的特异分子标志具有重要的临床意义。　　SHP-1蛋白为非受体酪氨酸磷酸酶，主要在造血组织表达，在负调控JAKs/STATs、PI3K/AKT/mTOR等与细胞增殖相关的信号通路中起着至关重要的作用。研究发现诱导分化剂诱导K562细胞分化过程中SHP-1重新表达;并且SHP-1蛋白可与BCR-ABL1融合蛋白结合抑制其恶性转化作用;小鼠动物模型中外源性融合蛋白ABD/SHP-1能有效抑制BCR-ABL1的致白血病作用。以上研究均表明SHP-1基因与CML的发生、发展有着密切的关系。　　表观遗传学是指在不改变DNA序列的前提下调控基因的表达。表观遗传学包括DNA甲基化、组蛋白修饰以及由非编码RNA调控的mRNA表达等。近年的大量研究表明，遗传学中基因启动子区甲基化程度的改变对疾病的发生发展起重要作用。肿瘤发生中表观遗传学异常是目前研究的热点，DNA甲基转移酶(DNA methytransferases，DNMTs)在基因异常甲基化中扮演着重要的角色，DNA甲基化修饰是表观遗传修饰的一个重要方式，与多种抑癌基因沉默及恶性肿瘤的发生有关。但SHP-1基因在CML急性转化中的作用及作用机制尚无报道，本研究旨在探讨SHP-1基因异常表达及甲基化与CML疾病进展的关系及CML疾病进展中SHP-1基因异常甲基化的调控机制。本研究论文分为三部分:　　第一部分、慢性髓性白血病患者SHP-1基因表达及甲基化状态的研究　　目的:通过检测SHP-1基因mRNA及蛋白在CML患者骨髓或外周血单个核细胞中的表达，及SHP-1基因启动子区CpG岛的甲基化状态，探讨SHP-1基因启动子甲基化状态与基因沉默在CML疾病进展中的作用。　　方法:选取2010年1月～2013年6月河北医科大学第二医院及衡水市哈励逊国际和平医院血液科慢性髓性白血病患者骨髓及外周血标本94例。健康志愿者外周血标本11例。应用SYBR Green荧光定量PCR及Western Blot方法检测骨髓或外周血单个核细胞细胞中SHP-1基因的表达情况，应用MSP的方法检测SHP-1基因启动子区CpG岛的甲基化状态。　　结果:　　1.CML患者的临床特征94例CML患者中，CP-CML42例、AP-CML22例、BP-CML30例，其中男性54例，女性40例;年龄8岁～72岁，中位年龄47岁。42例CP-CML患者中，男性24例，女性18例;年龄8岁～72岁，中位年龄45岁，白细胞计数(WBC)33～427×109/L，中位WBC计数199×109/L，血红蛋白(Hg)62～138g/L，中位Hg为95g/L，血小板计数(PLT)39～998×109/L，中位PLT为470×109/L。22例AP-CML患者中，男性14例，女性8例;年龄33岁～69岁，中位年龄45岁，WBC60～373×109/L，中位WBC199×109/L，Hg68～138 g/L，中位Hb为88 g/L，PLT87～1147×109/L，中位PLT为350×109/L。33例 BP-CML患者中，男性16例，女性14例;年龄8岁～68岁，中位年龄50岁，WBC60～356×109/L，中位WBC236×109/L,Hg62～117 g/L,中位Hg89 g/L，PLT54～1208×109/L，中位PLT308×109/L，CML患者3个不同时期CP-CML、AP-CML和BP-CML的临床特征无统计学差异，P＞0.05。　　2.CML患者SHP-1mRAN的表达SYBR Green荧光定量PCR结果显示，健康正常对照组(NC)、CP-CML、AP-CML、BP-CML组骨髓或外周血单个核细胞SHP-1mRNA的相对表达水平分别为:1.23±0.53、8.06±4.33、5.34±2.47、5.32±2.69，CML患者SHP-1mRNA表达水平较NC组表达水平表达水平增高，有统计学意义，P＜0.05。其中，CML慢性期患者表达水平最高，与加速期及急变期患者比较表达水平增高，有统计学意义，P＜0.05。CML加速期与CML急变期患者SHP-1mRNA表达水平无统计学差异，P＞0.05。　　3.CML患者SHP-1蛋白表达水平Western blot方法检测CML患者骨髓单个核细胞中SHP-1蛋白的水平，选择CML3个不同时期的患者各10例。结果表明SHP-1蛋白在CML慢性期患者表达水平最高，与加速期及急变期患者比较表达水平增高，有统计学意义，P＜0.05。CML加速期与CML急变期患者SHP-1蛋白表达水平无统计学差异，P＞0.05。　　4.CML患者SHP-1基因启动子甲基化状态采用MSP方法检测了CML患者SHP-1基因DNA启动子的甲基化状态。结果显示，42例CP-CML患者中10例检测到SHP-1基因DNA启动子的甲基化，阳性率为23.8％，CML进展期患者，包括AP-CML及BP-CML患者，均检测到SHP-1基因DNA启动子的甲基化。CML进展期患者SHP-1基因DNA启动子的甲基化阳性率较CP-CML组，明显增高，有统计学意义， P＜0.01。　　第二部分、SHP-1基因对K562细胞生物学特征的影响及机制探讨　　目的:探讨SHP-1对人原代慢性髓性白血病急变细胞系K562细胞增殖、凋亡及细胞周期分布的影响，并对其可能的作用机制进行初步探讨。　　方法:将携带SHP-1基因和绿色荧光蛋白空载体的慢病毒表达载体感染K562细胞。CCK-8及细胞计数方法检测细胞生长情况;流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期分布和pCrkL水平;Western Blot检测各转染组SHP-1、BCR-ABL1、AKT、MAPK、JAK2蛋白及磷酸化AKT、MAPK、JAK2、STAT5蛋白水平;荧光探针定量PCR检测BCR-ABL1mRNA水平。采用CCK-8方法测定伊马替尼及尼罗替尼的半数抑制浓度(IC50)。　　结果:　　1.重组慢病毒的转染效率倒置荧光显微镜下观察不同感染复数(MOI)下慢病毒转染K562细胞的效率。细胞在第72h达到最高转染率，分别为:MOI=0转染效率=0％; MOI=50转染效率=22.5±3.3％; MOI=100转染效率=50.9±4.4％; MOI=200转染效率=76.2±5.8％我们选用MOI=200进行感染。　　2.嘌呤霉素浓度筛选嘌呤霉素终浓度分别为0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml共6个浓度梯度，作用72h，最终确定嘌呤霉素的最佳帅选浓度为1μg/ml。　　3.伊马替尼及尼罗替尼IC50的测定伊马替尼或尼罗替尼终浓度分别为0.04μM、0.08μM、0.16μM、0.32μM、0.63μM、1.25μM、2.5μM、5μM，处理72h后测定细胞存活率。伊马替尼0.04μM、0.08μM、0.16μM、0.32μM、0.64μM、1.25μM、2.5μM、5μM不同浓度对K562细胞的抑制率分别为9.77±0.56、11.71±0.13、25.18±0.84、56.47±0.81、80.11±1.89、90.578±0.76、91.93±2.02、92.67±2.29，IC50为0.216±0.062μM。尼罗替尼0.04μM、0.08μM、0.16μM、0.32μM、0.63μM、1.25μM、2.5μM、5μM不同浓度对K562细胞的抑制率分别为10.73±0.83、14.25±2.66、51.18±1.25、60.35±2.11、80.72±1.82、90.23±1.23、92.22±2.66、96.20±2.80，IC50为0.162±0.176μM。　　4.酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)对K562细胞SHP-1表达及甲基化状态的影响MSP结果显示NC外周血单个核细胞均未发现甲基化，K562细胞SHP-1基因DNA启动子存在甲基化。SYBE Green定量PCR检测K562细胞SHP-1mRNA表达水平较为0.03±0.01，较NC外周血单个核细胞(1.23±0.53)明显降低，P=0.005。western blot方法未检测到K562细胞中SHP-1蛋白的表达，而正常NC外周血单个核细胞中SHP-1蛋白阳性表达。伊马替尼0.2μM及尼罗替尼0.15μM分别作用于K562细胞72h。WB方法检测发现K562细胞，未检测到SHP-1基因启动子的甲基化状态的变化，同时未检测到SHP-1蛋白。　　5.慢病毒感染后SHP-1蛋白的检测MOI=200感染K562细胞。感染EX-SHP1-Lv105及EX-EGFP-Lv105后72h western blot法检测SHP-1蛋白表达，结果显示K562EGFP细胞中未检测到SHP-1蛋白，K562SHP-1细胞中SHP-1蛋白阳性。　　6.SHP-1抑制K562细胞增殖嘌呤霉素筛选稳定转染EX-SHP1-Lv105及EX-EGFP-Lv105的K562细胞，CCK-8及细胞计数法检测K562SHP-1及K562EGFP细胞的增殖情况。培养d1～ d6的细胞计数显示，感染EX-SHP1-Lv105的K562SHP-1细胞计数分别为4.67±0.58、6.67±0.58、8.33±0.58、13.67±0.58、20.33±1.53、48.00±6.00、56.67±3.51，感染EX-EGFP-Lv105的细胞K562EGFP的细胞计数分别为4.67±0.58、7.67±0.58、10.33±1.53、19.00±2.00、39.67±1.53、82.67±4.16、109.00±9.17。K562SHP-1细胞计数自培养的d3起明显少于K562EGFP细胞，有统计学意义，P＜0.05;CCK-8检测结果相同，细胞培养d1～ d6，CCK-8检测的K562SHP-1的OD值分别为0.23±0.01、0.25±0.02、0.29±0.04、0.35±0.02、0.44±0.03、0.58±0.02、0.63±0.09，细胞培养d1～ d6，K562EGFP细胞的OD值分别为，0.23±0.01、0.26±0.04、0.35±0.02、0.47±0.05、0.73±0.09、1.08±0.22、1.13±0.13，OD值自细胞培养d3开始有统计学意义，P＜0.05。　　7.SHP-1使K562细胞周期阻滞在G0/G1K562细胞稳定转染EX-SHP1-Lv105及EX-EGFP-Lv105后培养，流式细胞仪检测细胞周期发现过表达SHP-1基因后，K562细胞增殖指数下降，自细胞培养d3开始，K562SHP-1细胞较K562EGFP细胞G0/G1期细胞比例逐渐增加,而S期细胞比例逐渐减少，P＜0.05; G2/M期细胞比例无明显变化，P＞0.05。　　8.SHP-1促进K562细胞凋亡流式细胞仪凋亡检测显示K562SHP-1细胞的凋亡率（早期凋亡及晚期凋亡）d1～d6分另为5.77±0.21、7.73±1.76、19.40±2.76、22.20±1.57、26.13±1.16、30.40±1.51，d1～d6的K562EGFP细胞的凋亡率分别为5.3±0.40、6.20±0.62、6.90±0.70、6.2±0.63、9.00±1.22、9.30±1.51，凋亡比例自细胞培养d3起有统计学意义，P＜0.05。　　9.SHP-1对K562细胞BCR-ABL1表达的影响转染EX-SHP1-Lv105及EX-EGFP-Lv10524h时，K562SHP-1细胞BCR-ABL1mRNA的相对表达水平为1.32±0.24，K562EGFP细胞BCR-ABL1mRNA的相对表达水平为1.18±0.20，两者比较无统计学差异，P=0.64。　　转染EX-SHP1-Lv105及EX-EGFP-Lv10548h时K562SHP-1细胞细胞BCR-ABL1蛋白的表达水平为0.78±0.15，低于K562EGFP细胞BCR-ABL1蛋白的水平1.27±0.24，P=0.038。　　10.SHP-1对K562细胞BCR-ABL1活性的影响K562SHP-1细胞中pCrkL的MFI值为5751.00±546.20，明显低于K562EGFP细胞的MFI值15599.33±2106.00，P＜0.01。　　伊马替尼处理后K562SHP-1细胞及K562EGFP细胞MFI均下降，分别为677.33±98.28、6196.67±194.56，两组MFI值差别有统计学意义，P＜0.01。　　11.SHP-1对K562细胞非BCR-ABL1依赖信号分子表达及活性的影响K562SHP-1细胞中MYC及磷酸化AKT、MAPK、JAK2、STAT5蛋白的水平低于K562EGFP细胞，P＜0.05。而K562EGFP及K562SHP-1细胞中AKT、MAPK、JAK2蛋白水平无差异，P＞0.05。　　伊马替尼处理后K562SHP-1细胞中MYC及磷酸化AKT、MAPK、JAK2、STAT5蛋白的水平仍低于K562EGFP细胞，P＜0.05。而K562EGFP及K562SHP-1细胞中AKT、MAPK、JAK2蛋白水平无变化，P＞0.05。　　第三部分、慢性髓性白血病细胞中DNA甲基转移酶与SHP-1基因沉默　　目的:探讨慢性髓性白血病细胞及CML疾病进展中DNA甲基化转移酶对SHP-1基因沉默及甲基化的影响。　　方法:应用SYBR Green荧光定量PCR方法检测3个不同时期CML患者及健康志愿者骨髓或外周血单个核细胞细胞中DNMTs基因的表达情况，并分析其表达水平与SHP-1mRNA表达的相关性;检查伊马替尼处理K562细胞时DNMTs与SHP-1mRNA表达的变化;转染携带shRNADNMT1质粒到K562细胞中，MSP检测SHP-1甲基化状态;WesternBlot检测DNMT1沉默后SHP-1、BCR-ABL1、AKT、MAPK、JAK2蛋白及磷酸化AKT、MAPK、JAK2、STAT5蛋白水平。　　结果:　　1.CML患者DNA甲基转移酶(DNMTs) mRAN表达水平健康正常对照组(NC)、CP-CML、AP-CML、BP-CML组骨髓或外周血单个核细胞DNMT1mRNA的相对表达水平分别为1.45±0.22、1.83±0.63、2.95±0.87、3.24±1.39。CP-CML患者较NC组表达水平无变化，P=0.28。CML疾病进展期较NC组表达水平增高，AP-CML与NC组相比，P=0.001，BP-CML与NC相比，P＜0.001; CML疾病进展期较CP-CML表达水平增高，AP-CML与CP-CML相比，P=0.012;BP-CML与CP-CML相比，P=0.001; AP-CML与BP-CML相比表达水平无差异，P=0.336。　　NC、CP-CML、AP-CML、BP-CML组骨髓或外周血单个核细胞DNMT3a mRNA的相对表达水平分别为1.29±0.34、1.34±0.46、2.33±1.05、3.18±1.23。CP-CML患者较NC组表达水平无变化，P=0.844。CML疾病进展期较NC组及CP-CML表达水平增高，CML进展期与NC组相比，P=0.002，BP-CML与NC相比，P＜0.001; CML疾病进展期较CML慢性期表达水平增高，AP-CML与CP-CML相比，P＜0.001;BP-CML与CP-CML相比，P=0.001; AP-CML与BP-CML相比表达水平无差异，P=0.304。　　NC、CP-CML、AP-CML、BP-CML组骨髓或外周血单个核细胞DNMT3b mRNA的相对表达水平分别为1.37±0.31、16.41±22.50、9.36±5.50、12.17±13.44。CML患者较NC组表达水平增高，P＜0.05。CML患者各期之间比较无统计学差异， P＞0.05。　　2.CML患者DNMTs与SHP-1基因mRNA表达的相关性CML患者骨髓或外周血单个核细胞中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b与SHP-1基因mRNA水平均呈成负相关，P＜0.001。　　3.伊马替尼对K562细胞SHP-1及DNMTs基因mRNA表达的影响伊马替尼处理前SHP-1mRNA相对表达水平为0.99±0.15，处理后SHP-1mRNA的相对表达水平为0.54±0.10，处后SHP-1mRNA水平降低，P=0.013;伊马替尼处理前DNMT1mRNA相对表达水平为1.10±0.27，处理后DNMT1mRNA的相对表达水平为3.06±0.76，处后DNMT1mRNA水平升高，P=0.014;伊马替尼处理前DNMT3a mRNA相对表达水平为1.20±0.41，处理后DNMT3a mRNA的相对表达水平为2.63±0.63，处后DNMT3a mRNA水平升高，P=0.029;伊马替尼处理前DNMT3b mRNA相对表达水平为1.06±0.18，处理后DNMT3b mRNA的相对表达水平为1.95±0.46，处后DNMT3b mRNA水平升高，P=0.034。　　4.电转染效率电转染后细胞存活率为34.2％，活细胞转染率为58.3％。电转染HSH004407-HIVmU6（shRNADNMT1质粒）后DNMT1蛋白表达水平明显降低。　　5.DNMT1基因沉默对K562细胞SHP-1基因启动子甲基化及mRAN表达水平的影响K562细胞DNMT1基因沉默后，SHP-1基因启动子出现去甲基化，同时SHP-1mRNA相对表达水平为14.23±3.83，较空白对照组(1.031±0.156)明显升高，P=0.004。　　6.DNMT1基因沉默对K562细胞BCR-ABL1活性的影响K562细胞DNMT1基因沉默后，pCrkL平均荧光强度(MFI)为8103±929，较对照组(11391±1191)降低，P=0.02。　　7.DNMT1基因沉默对K562细胞非BCR-ABL1依赖信号分子表达及活性的影响K562细胞DNMT1基因沉默后，MYC及磷酸化AKT、MAPK、JAK2、STAT5蛋白的水平降低，wester blot条带灰度比值有统计学差异，P＜0.05;而AKT、MAPK、JAK2蛋白水平无变化，P＞0.05。　　结论:　　1.慢性髓性白血病进展期患者中SHP-1基因启动子CpG岛甲基化程度增高，其表达水平降低。　　2.慢性髓性白血病疾病进展期SHP-1基因启动子CpG岛甲基化可能与DNA甲基化转移酶（DNMT1、DNMT3a、DNMT3b）表达水平增高有关。　　3.K562细胞中SHP-1基因可能通过负调控MAPK、AKT、JAK2/STATS信号通路抑制细胞增殖、促进G0/G1期阻滞及诱导细胞凋亡。　　4.K562细胞中SHP-1基因对BCR-ABL1具有抑制作用，能降低p210BCR-ABL1融合蛋白的水平并抑制其活性。　　5.K562细胞中DNMT1基因沉默能促进SHP-1基因启动子去甲基化，恢复SHP-1基因的表达。　　6.DMTs促进SHP-1基因启动子甲基化而致基因沉默可能与慢性髓系白血病疾病进展有着密切的关系。　　.