氟络草酮(Fluorochloridone, FLC)是一种吡咯烷酮类除草剂,化学名称为(3RS,4RS;3RS,4RS)-3-氯-4-氯甲基-1-(α,α,α-三氟间甲基)-2-吡咯烷酮。FLC在欧盟和北美国家中广泛应用,国内也已经引入该药,已在中国农药信息网(ICAMA)获得临时登记。文献公布的FLC毒性研究资料非常少,仅JOURNAL OF ANDROLOGY在1986年发表的两篇会议文摘,指出FLC可引起雄性大鼠出现睾丸萎缩,精子数量和质量下降,血清卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone, FSH)升高,生殖功能下降。2010年底,欧洲食品安全局(European Food Safety Authority (EFSA))公布的FLC毒性评价报告指出,FLC具有可能的雄性生殖毒性,其毒作用靶器官是睾丸与附睾,主要表现为精子数量下降、异常增多,Sertoli细胞(支持细胞)空泡化。2011年3月,欧盟委员会健康与消费者保护总司在发布的报告中指出FLC是可能的环境内分泌干扰物。本课题的研究目的包括评价FLC对SD大鼠睾丸的影响、FLC诱导生精细胞凋亡及其可能机制探索和FLC对Sertoli细胞的损伤作用。通过建立SD雄性大鼠FLC暴露模型和Sertoli--生精细胞共培养、原代培养Sertoli细胞模型,评价FLC的睾丸毒性,探究其发生的主要通路机制,为FLC健康危险度评价提供基础资料,并为认识类似结构除草剂的生殖毒性提供借鉴。一、FLC对SD大鼠睾丸的影响40只SD雄性大鼠随机分为溶剂对照组和FLC低(30 mg/kg bw/d)?中(150 mg/kg bw/d)、高(750 mg/kg bw/d)剂量组,每组10只。SD大鼠经灌胃染毒,给药容剂为1mL/100g bw,每日一次,连续灌胃给药28天。染毒结束后,运用睾丸组织病理检查、曲细精管超微结构电镜观察、附睾尾精子计数和血清睾酮(Testoterone, T)水平等指标,评价FLC的睾丸毒性。应用试剂盒检测睾丸组织中丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、过氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶(Glutathioereductase,GSH-GR)和谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferase,GSH-ST)水平。1.FLC影响睾丸组织氧化应激平衡。其中,中、高剂量组脂质过氧化标志物MDA含量明显增加,各剂量组GSH含量均明显下降,与对照比较,差异有统计学意义(p<0.05或p<0.001)。抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px,GSH-GR和GSH-ST,均在FLC的影响下出现了不同程度的活力下降,其中高剂量组与对照组相比,以上抗氧化酶活力均出现有统计学意义的下降(p<0.05或p<0.001)；中剂量组除GSH-GR外,其它的抗氧化酶均出现有统计学意义的活力下降(p<0.05或p<0.001)；低剂量组只有CAT和SOD活力显著降低(p<0.05或p<0.001)。2.FLC对SD大鼠睾丸毒性主要表现为,高剂量组大鼠睾丸质量、睾丸脏器系数、附睾质量、血清T水平和附睾尾精子计数与对照相比显著下降(p<0.05或p<0.001)。睾丸组织病理检查：中、高剂量组大鼠睾丸出现不同程度的损伤,包括1)间质水肿；2)曲细精管结构改变,萎缩；3)曲细精管生精上皮退化变性,生精细胞脱落至曲细精管管腔面；4)精母细胞、精子细胞死亡,管腔内出现多核巨细胞；5)部分曲细精管内的生精细胞耗竭；6)支持细胞空泡化；7)生精细胞细胞核损伤。曲细精管电镜观察显示生精细胞碎裂,精子细胞核仁、线粒体结构异常。睾丸质量,睾丸脏器系数、附睾质量、附睾尾精子计数、血清睾酮和睾丸组织病理学检查的基准剂量95%置信区间下限值(95% lower confidence limit of benchmark dose, BMDL)分别为：65.7、76.0、23、2.4、99.9和12.9 mg/kg bw/d。因此,本研究中附睾尾精子计数和睾丸组织病理损伤是对FLC暴露较为敏感的指标。二、FLC诱导原代培养Sertoli-生精细胞凋亡及其可能信号通路机制选择出生后28-30天的雄性SD大鼠,采用两步酶消化法制备Sertoli-生精细胞原代共培养体系。设立0.1%二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)溶剂对照组和3个FLC剂量组(10-8、10-7和10-6M)。实验结果显示：1.按以上剂量染毒6和24h后,开展四甲基偶氮唑盐(Thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT)试验和生精细胞脱落计数,结果显示,相对溶剂对照组,染毒6h后,高剂量组细胞活力降至84.76±4.91(%),染毒24 h后,各剂量组细胞活力分别降至72.16±2.53、50.62±4.13和44.30±12.66(%)(p<0.001)。FLC染毒6、12、24和48 h后,各剂量组生精细胞脱落相对溶剂对照组,均显著增加(p<0.05或p<0.001),且呈剂量-反应关系和时间-剂量关系。2.FLC染毒24 h后,收集剂量组与溶剂对照组脱落的生精细胞和培养的贴壁细胞(包括贴壁培养的Sertoli细胞和黏附于其上的生精细胞),用annexin Ⅴ结合试验检测各组细胞凋亡情况。与各自的溶剂对照组相比,各剂量组脱落的生精细胞中,早期凋亡细胞百分比明显增高至24.25±2.88,33.08±2.43和29.23±2.54(%),晚期凋亡／坏死细胞百分比明显增高至17.35±1.16,23.14±1.06和20.70±0.48(%),差异有统计学意义(p<0.05或p<0.001)。各剂量组共培养的Sertoli-生精细胞与对照组相比,早期凋亡细胞百分比显著增加至10.80±1.86,13.52±0.72和16.62±0.35(%),差异有统计学意义(p<0.05或p<0.001),但晚期凋亡／坏死细胞百分比没有显著性改变。3.FLC染毒24、48和72h后,对Sertoli-生精细胞共培养体系中Fas/FasL、线粒体凋亡信号通路,以及核因子活化B细胞K轻链增强子(Nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells, NFκB)、促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号通路相关基因表达的影响。FLC染毒24 h使中剂量组半胱氨酸的冬氨酸蛋白水解酶(Cysteiny1 aspartate specific proteinase, caspase)8基因表达水平明显升高(p=0.006)；染毒24、48与72h后,高、中、低剂量组均使B淋巴细孢瘤基因-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表达水平不同程度显著下降(p<0.05或p<0.001),呈剂量-反应关系和时间-反应关系；FLC也上调了Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein, Bax)、Bcl-2相关死亡启动子(Bcl-2-Associa ted Death promoter, Bad)、细胞色素c (Cytochrome c)、caspase 9和caspase 3基因的表达水平。FLC染毒72 h后,中、高剂量组NFκB家族成员P50、P65基因表达显著上调(p<0.05或p<0.001)。而高剂量FLC染毒24 h即可使高剂量组p38 MAPK基因表达明显增加(p=0.014),染毒48和72h,各剂量组p38丝裂素活化蛋白激酶(p38-Mitogen activated protein kinase, p38 MAPK)基因表达都显著增加(p<0.05或p<0.001),FLC对p38 MAPK基因表达的影响呈剂量-反应和时间-反应关系。三、FIC对大鼠原代培养Sertoli细胞的毒作用选择出生后18-21天的雄性SD大鼠,采用两步酶消化制备Sertoli-生精细胞,细胞接种24h后,用20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)低渗处理,纯化Sertoli细胞,建立Sertoli细胞原代培养体系。通过原代Sertoli细胞生长曲线,确定纯化后第2天开始对数生长期。设立0.1% DMSO溶剂对照组和3个FLC剂量组(10-、10-7和10-6M)。1.按以上剂量染毒6、12和24h后,开展MTT试验。染毒12h中、高剂量组原代培养Sertoli细胞增殖活力明显下降(p<0.001)。染毒24 h各剂量组细胞增殖活力分别降至74.7±2.5、56.1±4.4和52.3±6.4(%)(p<0.05或p<0.001),呈剂量-反应关系。2.免疫荧光染色试验显示,FLC染毒6、12、24、48与72h,紧密连接(Tight junction, TJ)的重要组成蛋白封闭蛋白(Occludin)与闭锁小环蛋白-1(Zonula occludens-1,ZO-1)水平发生变化。染毒6h,中、高剂量组Occludin蛋白水平明显变化(p≤0.001)。染毒24和48h,各剂量组诱导Occludin水平更明显下降(p<0.05或p<0.001)。高剂量染毒24h使Occludin基因表达显著下调(p=0.006)。FLC处理原代培养Sertoli细胞12h,中、高剂量组ZO-1蛋白表达显著下调(p<0.001)。染毒24和48h,各剂量组诱导ZO-1表达下降更为明显(p<0.05或p<0.001),呈剂量依赖性。染毒24、48与72h中、高剂量组ZO--1基因表达显著下调(p<0.05),ZO-1基因水平随着FLC浓度的增加而降低,呈剂量-反应关系。3.按以上剂量染毒6、12、24、48与72h,FLC对原代培养Sertoli细胞分泌功能相关基因表达有不同程度的影响。染毒24、48和72h,各剂量雄激素结合蛋白(Androgen binding protein, ABP)基因表达随剂量增加而下调；染毒6、12和72h,高剂量组转铁蛋白(Transferrin, Tf)基因表达显著下调(p<0.05)。FEC染毒24和48h抑制素B(Inhibin B, INHB)基因表达随FLC浓度的增加而降低,呈现剂量-反应关系且各剂量组INHB基因表达与其相应的溶剂对照组相比有显著下调(p<0.05或p<0.001)。染毒72h,只有高剂量组INHB基因表达明显下调(p=0.031)。总结上述实验结果,FLC染毒28天可使SD雄性大鼠睾丸组织氧化应激水平升高、降低血清睾酮水平、睾丸曲细精管生精上皮退行性改变、Sertoli细胞空泡化,含吞噬小体的多核巨细胞增多,附睾尾精子计数下降。FLC可通过抑制Bc1-2和上调Bax和Bad基因表达,使Sertoli-生精细胞共培养体系内生精细胞发生凋亡。内源性凋亡信号通路可能是其主要的凋亡机制之一。同时NFκB和p38 MAPK信号通路也可能通过抑制抗凋亡基因Bcl-2和／或上调促凋亡蛋白基因Bax和Bad表达,参与调节FLC引起的Sertoli-生精细胞共培养体系中细胞凋亡。在原代培养Sertoli细胞中,FLC降低了TJs结构蛋白Occludin与ZO-1水平,影响BTB结构完整性；同时Sertoli细胞旁分泌的重要蛋白一--ABP、Tf和INHB相关基因表达也在FLC影响下下调。说明FLC对Sertoli细胞存在毒作用。由此,我们提出FLC睾丸毒性的可能机制是：1)诱导睾丸组织产生氧化应激,损伤睾丸组织结构的完整性,破坏生精过程需要的特定微环境；2)直接作用于生精细胞,通过内源性信号通路主导,NFκB信号通路和p38MAPK信号通路协助,诱导生精细胞凋亡,破坏正常的生精过程；3)影响Sertoli细胞TJs结构蛋白表达,破坏BTB结构完整性；使Sertoli细胞旁分泌功能受损,无法维持曲细精管内生精细胞分化生长所需的高浓度睾酮和铁,干扰生精过程。