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【研究背景】醛糖还原酶（Aldose reductase，AR）是糖代谢中多元醇通路的限速酶，负责将葡萄糖转化成山梨醇。但是最近的研究发现，AR的作用并不仅仅局限于糖代谢过程，它还被视为介导多种炎症性疾病的靶分子。许多实验证实，AR抑制剂（AR inhibitor，ARI）可以有效地抑制炎症反应，而过表达AR会增强固有免疫反应。据报道，AR可能通过NF-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路调控炎症反应，但是机制尚不明确。经典NF-κB信号通路在固有免疫反应中发挥非常关键的作用，通过调控促炎细胞因子转录，募集并活化炎症细胞来执行炎症反应。经典NF-κB信号途径依赖IKKβ，IKKβ存在于一个与IKKα和IKKγ密切相关的复合体中。炎症刺激活化IKKβ，后者使IκBα泛素化降解，最终激活NF-κB信号通路，启动炎症相关基因转录。自噬（Autophagy）是指胞浆内的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的蛋白质、细胞器和病原体等成分形成自噬体（Autophagosome），并与溶酶体融合形成自噬溶酶体（Autolysosome），降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新及清除入侵的病原体。微管相关蛋白轻链3（MAP-LC3），包括I型和II型，II型由其前体I型切掉羧基端30个氨基酸后与磷脂酰乙醇胺（PE）连接而形成。LC3II参与自噬泡膜的成熟过程并分布于膜的两侧，因此，通常把它作为成熟自噬泡的标记物。选择性自噬是指游离膜结构识别并包裹胞质内的特定底物形成自噬体，并将其降解，比如蛋白聚合物自噬。自噬对蛋白聚合物的降解需要泛素及p62/SQSTM1（Sequestosome1）的参与。p62作为自噬受体，含有泛素相关结构域（Ubiquitin-associated domain， UBA)，识别并结合K63-聚泛素化的底物（K63-polyubiquitinated substrates），然后进一步与泛素样蛋白（Ubiquitin-like protein）LC3结合，从而使底物进入自噬降解途径。近年来，许多研究发现细胞自噬与固有免疫反应有着广泛的相互调控作用。一方面，固有免疫信号可以诱导或抑制自噬，自噬是固有免疫的重要组成成分，在抗胞内病原体感染中发挥效应器（Effector）作用，最终通过溶酶体降解被自噬体包裹的病原体。另一方面，自噬也参与众多固有免疫信号的调控，然而具体的机制依然不清。我们前期研究发现：AR参与脊髓损伤后巨噬/小胶质细胞的极化过程；同时我们体外预实验发现，LPS诱导的AR缺陷（AR knock-out或者knock-down）巨噬细胞的iNOS表达量较AR正常组低，而自噬水平（LC3II/LC3I）较AR正常组高。那么AR，自噬和固有免疫反应这三者之间有着怎样的联系呢？【目的】研究AR，自噬和固有免疫反应之间的相互关系，阐明AR对固有免疫反应的调控机制。【方法】1)培养细胞：野生型（Wide type，WT）和AR敲除型（AR knock-out，AR KO）C57BL/6J小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）和来源于小鼠巨噬细胞瘤的RAW264.7细胞系。2)设计AR siRNA，转染到RAW264.7细胞，并评价效果。3)体外模拟炎症反应，提总蛋白，western blot检测各组经典NF-κB信号通路上下游的关键分子TLR4，IKKβ，IKKγ，IκBα，p62和iNOS，发现LPS诱导的AR缺陷（AR knockout或者knockdown）组IKKβ和IKKγ蛋白水平较AR正常组低。4)提总mRNA，qPCR检测各组IKKβ和IKKγ mRNA水平，发现LPS诱导的AR缺陷组IKKβ和IKKγ mRNA水平和对照组并没有差异，说明LPS诱导的AR缺陷巨噬细胞的IKKβ和IKKγ蛋白降低发生在转录后水平。5)爬片，免疫组化观察各组LC3（自噬体Marker）和LAMP1（溶酶体Marker）标记的巨噬细胞，了解AR缺陷对自噬体形成和成熟的影响；提总蛋白，westernblot检测各组LC3和LAMP1蛋白水平；收集细胞，制超薄切片，透射电镜观察各组自噬体和自噬溶酶体。6)爬片，免疫组化观察各组IKKβ、IKKγ分别与LC3和LAMP1的共标情况。7)爬片，免疫组化观察各组IKKβ、IKKγ分别与泛素（Ub）和p62的共标情况。8)用3-MA阻断自噬，提总蛋白，western blot检测各组LC3，IKKβ，IKKγ和iNOS的变化。【结论】1）AR缺陷对固有免疫反应的抑制是由于经典NF-κB信号通路中的IKK复合体（IKKβ和IKKγ）在转录后水平被降解；2）AR缺陷可以诱发自噬体形成，LPS刺激会进一步促进自噬体形成和自噬体成熟；3）LPS诱导的巨噬细胞的IKKβ和IKKγ广泛地与自噬体和溶酶体结合；4）LPS诱导的巨噬细胞的IKKβ和IKKγ广泛地泛素化并被p62识别结合；5）药物阻断自噬后，IKK复合体的蛋白水平和iNOS表达水平显著增高。综上所述，可以得出结论，AR缺陷通过激活自噬途径抑制固有免疫反应。