神经胶质瘤是指神经上皮来源的肿瘤,以星形胶质细胞瘤及胶质母细胞瘤为主,也包括少突胶质细胞瘤、混合性胶质瘤等。根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)分级标准,胶质瘤可分为四级。胶质瘤在颅内肿瘤中发病率位列第一,而其中位生存期不超过两年。因其恶性程度极高,虽然胶质瘤的发病率在各类肿瘤中排名并不靠前,但其致死率却一直居于肿瘤致死率的前两位。且胶质瘤发病没有明显的年龄相关性,在2016年的美国年度癌症数据报告中,脑肿瘤已成为青少年阶段致死率最高的肿瘤类型。过去十年,人们在肿瘤治疗方面取得了很多进展,放化疗对胶质瘤也可起到一定的限制作用,但胶质瘤患者的五年生存率却并没有因此获得很大提升。我们需要对胶质瘤及胶质瘤的“土壤”有更多更贴切的认识,也需要有更多可供选择的方法参与到胶质瘤的治疗之中。目前胶质瘤的治疗方式主要集中在化疗、放疗以及尽量完全的手术切除胶质瘤,而免疫治疗作为新型的肿瘤治疗方式,在应用于胶质瘤的治疗中尚方兴未艾。去甲二氢愈创木酸(NordihydroguaiareticAcid,NDGA)是一种天然化合物,提取自美洲沙漠的灌木三齿拉瑞尔(Larreatridentata),20世纪曾被广泛用作抗氧化剂,并应用于抵抗紫外线的治疗中。在过去三十年的研究中,NDGA被发现具有抗病毒,抗血管新生等新的作用,并发现能够对多种肿瘤具有直接的抑制作用。本实验室前期合成的NDGA同分异构体Nordy (dl-NDGA)是一个手性酚类小分子,具有抑制多种肿瘤的功能。本实验室以NDGA的化学结构为基础合成了新型小分子化合物NDGA-P21 (1,4-二(3, 4-二甲氧基苯基)-2, 3-二甲基-2, 3-环氧丁烷),相比于NDGA其主要的结构改变是在碳链上添加一个氧原子,构成环氧结构,从而增大其反应活性,同时保持NDGA两侧的主要效应基团,以保证新合成的小分子能够具有相似的生物作用。本研究以细胞相关实验证实了 NDGA-P21具有与Nordy相似或更强的能力抵抗胶质瘤增殖和抑制胶质瘤干细胞自我更新能力。肿瘤的发生并不仅仅是肿瘤细胞孤立活动的结果,肿瘤的发生和进展很大程度上跟它所处的环境有关,Paget的“种子和土壤”学说(“seed and soil”)即提出了这个问题。而R.A.Weinberg在其2011年关于肿瘤特征的综述中特别提出,与上一版他们提出的特征相比,近年的研究暴露了肿瘤的一个新特征,即其可以逃避免疫系统的追杀。肿瘤微环境,特别是肿瘤微环境中肿瘤特异性T细胞,在肿瘤的发生发展中被肿瘤细胞逐渐改造,直至“倒戈”。正常的T细胞能够识别并杀伤非自体的抗原。而在肿瘤微环境中,尽管有些肿瘤具有肿瘤特异性的抗原,肿瘤特异性T细胞也不能行使其杀伤作用,这就是困扰人们许久的“Hellstrom悖论”(“Hellstromparadox”)。这个过程,有肿瘤细胞自身的直接作用,有被改造的抗原提呈细胞的辅助作用,也是T细胞被肿瘤细胞改造的结果。出现变异的肿瘤细胞绕过了免疫系统的监管,或是使效应细胞耗竭失活,所以才能在机体内不受控制地生长。由于血脑屏障的存在,人们长期以来认为脑组织是免疫豁免的。然而,2016年Antoine Louveau等发现中枢神经系统也存在淋巴管及淋巴引流,这就为研究胶质瘤局部的淋巴细胞浸润提供了解剖基础。同时,随着胶质瘤发展,新生肿瘤血管的不连续性也为淋巴细胞突破血脑屏障,进入胶质瘤提供了可能。研究胶质瘤局部淋巴细胞的浸润情况对于这种恶性程度极高的肿瘤的认识十分重要。本研究发现在胶质瘤病人的瘤体局部存在一种特别的T细胞,它能够表达活化标记CXCR5以及抑制性T细胞标记PD-1,但这种细胞在外周循环的血液中却并不存在。我们因此假设T细胞进入胶质瘤组织局部后,被胶质瘤细胞驯化,从而出现了高表达PD-1的表型,并分泌IL-8等因子,使T细胞不能再继续发挥其监管杀伤作用,转而开始为肿瘤细胞增殖及免疫逃逸提供了可能性。而这群特异性的Tfh样T细胞也为胶质瘤的免疫治疗提供了新的可能的靶标。主要结果和结论如下:一、 小分子药物NDGA-P21对胶质瘤的抑制作用1.通过不同浓度下体外给药,以细胞计数法直接测算U87-MG细胞中药物IC50:NDGA-P21—7.43μmol/L, Nordy—34.52μmol/L;原代胶质瘤 GBM1 细胞中药物 IC50:NDGA-P21—55.54μmol/L,Nordy — 15.38μmol/L。连续观察各组 U87-MG 及 GBM1 细胞生长,细胞计数法测定两种细胞经DMSO、NDGA-P21及Nordy处理后的增殖曲线,发现相比于DMSO对照组,NDGA-P21及Nordy可以抑制明显胶质瘤细胞的增殖(P<0.05 )。2.流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡发现,NDGA-P21可使胶质瘤细胞阻滞在G0/G1期,而对凋亡并无明显影响。NDGA-P21可明显抑制G1-S期转换过程中的CCNE1、CDK2、CDK6的mRNA表达,并上调G2-M期的抑制性分子GADD45a的mRNA表达。说明NDGA-P21诱导胶质瘤细胞出现细胞周期阻滞。3. NDGA-P21可明显抑制胶质瘤干细胞的软琼脂克隆形成及成球能力(P<0.05),并且抑制干细胞转录因子Nanog的mRNA表达,说明NDGA-P21具有抑制胶质瘤干细胞自我更新的能力4.免疫荧光染色发现NDGA-P21可诱导胶质瘤干细胞表达已分化的胶质细胞标记物GFAP,从而说明NDGA-P21具有诱导胶质瘤干细胞分化的能力。二、胶质瘤微环境中的辅助性T细胞(Tfh)样T细胞浸润1.通过对胶质瘤患者瘤体组织局部淋巴细胞的流式细胞术检测及胶质瘤组织切片的免疫荧光分析,我们发现胶质瘤组织局部浸润有一群特异性高表达CXCR5及PD-1的T细胞,CXCR5与PD-1高表达被看作是次级淋巴结构中Tfh的标志分子,故称之为Tfh样T细胞。2.通过对比胶质瘤组织内浸润T细胞和外周血中T细胞,我们发现这群高表达CXCR5及PD-1的T细胞是具有组织特异性的,外周血中T细胞仅高表达CXCR5,而PD-1表达量却普遍很低。3.通过胶质瘤患者瘤体组织及外周血样本进行转录组水平测序分析,我们发现这群特异性T细胞的特征性基因群,并且通过分析特征基因群体性表达(CD3D,CD4,CXCR5, PD-1, IL1B,C1QB,FCERIG,IL1RN, FOSB,IL8, TREM2, CSF1, CCL3),发现Tfh样T细胞的富集与胶质瘤患者的预后呈负相关。4.通过小鼠原位胶质瘤移植瘤模型,我们检测了小鼠胶质瘤肿瘤特异性T细胞,发现小鼠胶质瘤中也存在一群Tfh样T细胞。5.敲除Tfh细胞后小鼠胶质瘤生长受到抑制,且T细胞耗竭标记物Tim-3表达降低。总之,本文的主要结论为:NDGA衍生物NDGA-P21具有对胶质瘤细胞增殖的直接抑制及对其自我更新能力的抑制的作用,从而对胶质瘤表现出良好的治疗前景。胶质瘤微环境中存在特异的Tfh样CD4~+T细胞,且其在瘤体的富集程度与胶质瘤患者预后相关。本文从胶质瘤的化疗和免疫治疗两个方向入手,探索了对胶质瘤治疗的新方向。