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间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的自我更新能力和多向分化潜能使之成为细胞疗法的理想种子细胞。人脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)由其易得性且在脂肪组织中含量丰富,是一种理想的MSCs。目前临床治疗普遍使用加入冻存保护剂二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)的冻存干细胞制剂。DMSO是一种有毒试剂,因此含有DMSO的干细胞制剂注射入人体内会引起严重的不良反应。少量文献报道了2-8℃低温短期不添加冻存保护剂的干细胞制剂形式,但是存在使用非临床用保存液、保存时间短、细胞活率下降快等缺点。本论文旨在通过综合的评价体系来研究ADSCs 2-8℃低温保存的保存液、保存时间和细胞浓度,得到一种能确保ADSCs临床移植前活率和功能,同时最大程度减少不良反应的低温制剂方案。方法:1、从人脂肪组织中分离ADSCs,并通过细胞形态、免疫表型、细胞增殖和成骨成脂分化能力来鉴定ADSCs的生物学特性。2、检测用含5%人血清白蛋白的复方电解质注射液(human serum albumin+multiple electrolytes,ME+HSA)、含5%人血清白蛋白的生理盐水(human serum albumin+normal saline,NS+HSA)、5%葡萄糖和生长培养基(growth medium,GM)低温保存的ADSCs的细胞活率和结团率、细胞凋亡、贴壁能力和克隆形成能力(colony-forming unit,CFU)。3、评价保存液之后,用细胞凋亡、贴壁能力和克隆形成能力来评价低温保存时间(24h和48h)。4、评价保存时间后,用细胞凋亡、贴壁能力、克隆形成能力、增殖能力和成骨成脂分化能力来评价细胞密度(1×10~6cells/ml、5×10~6cells/ml和10×10~6cells/ml)。5、得到最佳的保存液、保存时间、细胞密度的方案之后,用此方案保存ADSCs,测定细胞表面标记、细胞周期和免疫抑制能力来对此方案作出评价。结果:1、从脂肪组织中分离得到的细胞为ADSCs,细胞呈梭形生长,HLA-DR、CD34和CD45呈阴性表达,CD73、CD90和CD105呈阳性表达,细胞增殖迅速,成骨成脂分化能力强。2、ME+HSA是最优的保存液,ADSCs能保持较高的细胞活率,较低的结团率,良好的贴壁能力和较高的克隆形成能力。3、保存时间应该在24h以内,来确保移植用的细胞质量。随着保存时间延长至48h,细胞凋亡和未贴壁细胞个数显著增加,克隆形成能力显著下降。4、5×10~6cells/ml是最合适的细胞保存浓度,细胞晚期凋亡率低,增殖快,成骨和成脂分化能力好。5、ADSCs使用优选的方案保存后,免疫表型、细胞周期、吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO1)基因表达和犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)浓度未发生显著改变。结论:5×10~6cells/ml ADSCs悬浮在ME+HSA保存液中,保存24h以内是一种较好的有潜力应用于临床治疗的干细胞制剂方案。