【摘 要】
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研究目的:1.手足口样本的实验室诊断病例占临床诊断病例的比例较低,并且副肠孤病毒感染后的很多症状与手足口疾病症状相似,所以本研究对临床诊断手足口病例但是EV（-）的样本进行了 HPeV检测。2.尽管有证据表明HPeVs存在于各种严重的儿科感染性疾病中,但是在国内缺乏针对副肠孤病毒的监测。本研究建立副肠孤病毒的检测方法,弥补对副肠孤病毒监测的不足,具有重要的公共卫生意义和实际应用价值。3.在中国,针
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研究目的:1.手足口样本的实验室诊断病例占临床诊断病例的比例较低,并且副肠孤病毒感染后的很多症状与手足口疾病症状相似,所以本研究对临床诊断手足口病例但是EV（-）的样本进行了 HPeV检测。2.尽管有证据表明HPeVs存在于各种严重的儿科感染性疾病中,但是在国内缺乏针对副肠孤病毒的监测。本研究建立副肠孤病毒的检测方法,弥补对副肠孤病毒监测的不足,具有重要的公共卫生意义和实际应用价值。3.在中国,针对副肠孤病毒基因组特征的研究很少,所以本研究对2019年北京健康儿童粪便样本中检出的HPeV进行分子分型以及进化和重组规律的研究。实验方法:本实验建立了针对全部血清型HPeV的单管real-time RT-PCR检测方法,并对其敏感性、特异性和重复性进行了测试。利用2019年北京健康儿童的748份样本和2019年甘肃省1097份手足口病样本进行对该检测方法进行验证。设计针对VP1序列扩增的用于分子分型的引物序列,且利用高通量测序技术对阳性样本的全基因组序列进行测定,对VP1区域序列和全基因组序列进行进化重组分析。研究结果:1.建立了针对全部基因型HPeV的单管real-time RT-PCR检测方法,此检测方法只可特异性检测HPeV,最低检测下限（the limit of detection,LOD）为102拷贝数/μL,变异系数（CV）均小于1.5%。2.748份北京健康儿童粪便样本中,11份样本核酸检测阳性,均成功扩增出VP1区域,分子分型结果为8株HPeV-1,1株HPeV-4以及2株HPeV-6。3.利用HT-29,A549,Vero以及RD四种细胞系对核酸阳性样本进行病毒分离,其中2株（18.2%）在A549细胞上出现了细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）,3 株（27.3%）在 Vero 细胞上出现了 CPE,有 8 株（72.7%）在HT-29细胞上出现了 CPE,RD细胞中未出现CPE现象。4.利用高通量测序技术对11份核酸阳性样本进行全基因组测序,获得7条全序,其中6条HPeV-1,1条HPeV-6,经重组分析发现6株HPeV-1具有三种不同的重组模式,HPeV-6未发现重组现象。5.对2019年甘肃省1097份手足口样本进行HPeV检测,结果发现核酸阳性率为4.19%,未能分离到HPeV,且高通量测序结果仅有1株样本的部分3D序列,结果初步显示HPeV与手足口病之间的关联性不大。研究结论:1.本实验建立的real-time RT-PCR检测方法具有良好的特异性,灵敏性和重复性。2.在2019年北京健康儿童中,HPeV感染所占比例最高的是1型,其次是6型,与世界范围内的流行情况一致。3.在本研究中对HPeV病毒分离最敏感的细胞系为HT-29,但值得注意的是HPeV-3不能在此细胞上得到有效复制。4.利用高通测序技术获得7株全序,6株为HPeV-1,1株为HPeV-6,6株HPeV-1存在三种不同的重组模式,广泛与HPeV-5和HPeV-7存在重组现象;1株HPeV-6未发现任何重组现象。5.针对HPeV与手足口病之间的关系的初步探索发现HPeV与手足口病之间的关联性不大。
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