肿瘤相关巨噬细胞(Tumor Associated Macrophage,TAM)是一类大量浸润于多种器官肿瘤组织中的单核巨噬细胞,通过分泌的大量细胞因子、生长因子及其它多种活性介质作用于肿瘤微环境,与肿瘤细胞的免疫耐受、免疫逃逸密切相关。同时,TAM也受肿瘤微环境中多种活性因子的刺激作用,表现出高度的功能异质性和可塑性,进而参与调控肿瘤的发生发展,TAM已经成为当今肿瘤免疫治疗领域的研究热点。作为肿瘤组织中最为丰富的一类免疫细胞,TAM通过大量表达于其细胞膜表面的受体蛋白感知和接收肿瘤微环境中的信号,并通过受体的胞内信号转导调控其多种生理功能,最终调控TAM向具有特定生理功能的M1、M2型极化状态的转化。在众多TAM膜表面受体中,G蛋白偶联受体家族(GPCR)扮演着重要的角色,是TAM感知和接收肿瘤微环境中多种胞外信号的重要传感器。然而虽然目前己发现的GPCR达到826种,但对于其中参与调控巨噬细胞极化的GPCR却知之甚少。因此,为了深入探究肿瘤微环境通过GPCR等细胞膜受体对于TAM功能性极化的调控作用,我们借助RNA-Seq测序技术分析和归类了一系列在巨噬细胞M1/M2功能极化过程中出现差异表达的基因,并重点对其中GPCR受体家族成员进行了系统分析。我们发现,属于LGR(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor)家族成员之一的Lgr4在IL-4诱导的M2型巨噬细胞中表达上调,而在IFN-γ诱导的M1型巨噬细胞中表达下调,并通过实时定量PCR进行了验证。在此基础之上,我们发现Lgr4缺失型巨噬细胞表现出明显的的M1型功能特性,在IFN-γ介导的M1型极化过程中表达更高水平的IL-1β,TNF-α,CXCL10,iNOS等M1型标志基因,而在IL-4介导的M2型极化过程中表达更低水平的CD206、Arg1、Ym1等M2型巨噬细胞标志基因,表明Lgr4的缺失抑制了巨噬细胞的M2型功能极化,而促进其向抗肿瘤的M1型转化,提示我们Lgr4的缺失可能对于抑制TAM的促肿瘤表型具有重要作用。已有的文献表明,TAM功能性极化的改变对于肿瘤的发生发展具有重要的作用,为了探究LGR4通过调控TAM对于肿瘤生长的潜在作用,我们检索和分析了 TCGA、Oncomine肿瘤数据库,发现LGR4高表达于肺癌、乳腺癌等病人的肿瘤组织标本中,与患者的存活和预后存在显著负相关,并且LGR4及其配体RSPO的表达与肿瘤组织中M2型TAM的标志基因呈现良好的表达共定位和正相关。这提示了 LGR4与TAM的功能表型甚至与肿瘤的发生、发展之间存在着内在的联系。为了揭示LGR4、TAM以及肿瘤发生发展之间的联系,我们建立了一系列小鼠肿瘤模型并进行相应的病理检测和分析。在巨噬细胞与小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)的混合注射模型中,与野生型巨噬细胞相比,Lgr4-/-巨噬细胞能够显著抑制肿瘤细胞的生长;在乌拉坦(Urethane)诱导的自发性肺癌模型中,巨噬细胞中条件敲除Lgr4的Lgr4flox/flox,Lysm-Cre小鼠体内肿瘤生长明显迟滞于对照野生型小鼠;通过免疫荧光、流式细胞术对荷瘤小鼠肿瘤组织进行分析发现,Lgr4flox/flox,Lysm-Cre 小鼠中 M2 型(CD206+)TAM 比例减少,M1 型(CD16/32+)TAM比例增多,并且条件敲除小鼠肿瘤中更多的巨噬细胞高表达IL-12和TNF-α,呈现明显的抗肿瘤的M1功能表型;与此同时,条件敲除小鼠肿瘤组织内的CD8+T细胞浸润显著增多,提示Lgr4条件敲除小鼠体内的抗肿瘤免疫功能得到了显著提升。同时在LLC细胞皮下荷瘤模型以及B16F10黑色素瘤模型中也得到了类似的结果。表明Lgr4的缺失改变了肿瘤微环境中TAM的功能状态,引发更多的CD8+T细胞,最终抑制了肿瘤的发生发展。为了进一步探究Lgr4调控巨噬细胞功能极化的机制机理,我们利用Lgr4配体Rspondin1和Rspondin3蛋白对Lgr4+/+和Lgr4-/-骨髓来源巨噬细胞进行处理,结果显示Rspondin1和Rspondin3均可促进骨髓来源巨噬细胞向M2方向极化,并且Rspondin1可以明显激活和提高Lgr4+/+巨噬细胞Erk及Stat3的磷酸化水平,而对于Lgr4-/-巨噬细胞则无明显作用,与采用IL-4刺激后的结果一致;随后我们使用Stat3激动剂在细胞以及动物体内水平上对Lgr4/Stat3调控巨噬细胞功能极化的作用进行了验证。最后,我们利用LGR4胞外段蛋白(LGR4 Extracellular Domain,LGR4-ECD)以及抗Rspondin1单克隆抗体竞争阻断肿瘤组织中的Rspondin1对Lgr4的激活,从而显著抑制了 LLC荷瘤小鼠肿瘤的生长;此外,我们还将二者与PD-1单克隆抗体疗法联用,结果表明Lgr4信号的阻断显著提高了 PD-1对于B16F10小鼠黑色素瘤模型的治疗效果,起到了协同提高的作用。对肿瘤组织中免疫细胞进一步的分析表明:LGR4-ECD以及抗Rspondin1抗体的使用均明显改变了肿瘤组织中TAM的M1/M2功能状态,促进了 CD8+T细胞的浸润;而且,令我们惊讶的是,给药后的肿瘤组织中髓性来源抑制性细胞MDSC(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)也显著减少。综上,我们的结果揭示了 Lgr4对TAM功能性极化的重要调控作用,并从肿瘤免疫调控的角度阐明了 Lgr4与肿瘤发生、发展的关系。Lgr4对肿瘤免疫微环境的重要调控作用使其有望发展成为新型的肿瘤免疫治疗靶点,在肿瘤免疫治疗领域拥有巨大的应用和开发前景。