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微生物是目前最大的天然资源库。环境中有99%的微生物都是不可或者难以培养的,所以只有不到1%的微生物能够被人类认识并利用。20世纪末发展起来的宏基因组学是利用分子生物学技术绕过培养分离的方法来对微生物的多样性及其功能性进行研究的新兴科学。目前已经通过此技术筛选得到了大量新的功能基因,例如编码脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、水解酶、氧化还原酶等活性物质的基因。本文采用宏基因组文库的方法对土壤中编码脂类水解酶的基因进行筛选,利用功能筛选法即向平板中加入三丁酸甘油酯(Tributyrin)作为筛选底物获得了一个阳性克隆。该阳性克隆经过测序得知:此基因包含全编码区为1185 bp,编码394个氨基酸序列,理论分子量为40900 Da。Blastp分析表明该蛋白与Ralstonia pickettii 12J编码的酯酶(Genbank检索号:NC-010682.1)同源性最高为38%,且都具有GDSL水解酶超家族保守结构域。说明它可能是GDSL酯/脂肪酶家族重要成员之一。通过使用在线软件预测,该基因编码的蛋白可能含有信号肽。为防止信号肽影响可溶性蛋白的顺利表达,分别设计了含有信号肽和不含有信号肽的两种引物,扩增后的序列分别构建到原核表达载体中,经诱导培养后,可以明显看到不含信号肽的克隆有大量的蛋白表达。将克隆菌株进行超声破碎后,分别将裂解后的上清和沉淀进行SDS-聚丙烯酰胺凝聚电泳,从电泳结果得知:目的蛋白多数都以聚集体的形式出现在沉淀中。为了提高目的蛋白的溶解度,向裂解液中加入0.5%的脱氧胆酸钠可以获得大量的可溶性蛋白。对不含有信号肽的可溶性蛋白粗提液进行Ni-NTA亲和层析纯化和离子交换除盐处理获得纯酶液。对纯化的酶液进行酶学性质分析可知:该酶能水解对硝基苯乙酸(pNPC2),对硝基苯丁酸(pNPC4),对硝基苯辛酸(pNPC8),对硝基苯癸酸(pNPC10),对硝基苯月桂酸(pNPC12)等多种对硝基苯酯,且底物为pNPC10时水解活性最大,所以推测该蛋白是水解短链脂肪酸的酯酶。进一步测定此酶的最适温度和最适pH,发现其发挥最大酶活的pH为10.0,最适温度为47.5℃,属于中温耐碱性酯酶。通过向反应体系中加入不同的离子和去污剂,比较加入离子和去污剂前后酶活的变化可以得出结论:Cu2+、Mn2+、Mg2+、DOC(1%)、Tween-20(0.1%)都能够促进酶活;而Co2+、SDS(1%)、Triton X-100(1%)、Tween-20(1%)、Tween-80(0.1%)、Tween-80(1%)都对酶活性有一定的抑制作用;Ca2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+和SDS(0.1%)对酶活性影响不大。