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牙骨质是覆盖在牙根表面的一薄层类骨质,由成牙骨质细胞分泌的基质矿化沉积形成。牙周韧带的一端埋入牙骨质中,另一端埋入牙槽骨,将牙齿“锚定”在牙槽骨中。在病理状态如牙周炎,不恰当的正畸加力过程中,牙骨质会发生不同程度的吸收,造成牙体缺损,严重时甚至导致牙齿脱落。因此牙骨质的再生被认为是牙周再生的重要组成部分,研究成牙骨质细胞的分化增殖具有极其重要的临床意义。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)不能编码蛋白,长度超过200个核苷酸,在多种生命活动中起着重要的调节作用。LncRNA H19(H19)具有高度的保守性,以往的实验证明H19可以促进成骨细胞的分化,那么H19是否也能促进成牙骨质细胞的分化呢?有实验利用RNA测序发现,在牙周炎患者的成牙骨质细胞中H19的表达明显降低,这进一步提示H19很可能与成牙骨质细胞的功能状态有关。因此,本研究旨在探讨H19对成牙骨质细胞的分化、矿化与增殖能力的影响。第一部分成牙骨质细胞分化过程中lncRNA H19的表达变化目的:探讨成牙骨质细胞分化过程中,H19表达的变化。方法:OCCM-30是小鼠成牙骨质细胞系,用含10 mMβ-甘油磷酸钠、50μg/mL抗坏血酸、5%胎牛血清的矿化诱导培养基体外诱导OCCM-30细胞分化0、2、4、5、7天后,TRIzol收集总RNA,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测相关分化指标及H19的表达。结果:1.矿化诱导处理时间越久,相关指标ALP、RUNX2、OSX表达量越高,提示诱导分化成功。2.H19的表达变化与各分化指标的表达变化一致,0、2、4、5、7天的表达呈递增趋势,第七天增加更为明显。结论:H19表达上调,与成牙骨质细胞的分化呈现出正相关性。第二部分lncRNA H19对成牙骨质细胞分化能力的影响目的:通过过表达或敲低H19,探讨其对成牙骨质细胞分化能力的影响。方法:1.构建过表达H19的重组慢病毒,感染OCCM-30细胞,利用嘌呤霉素进行筛选,在不同时间点用TRIzol收取RNA,qRT-PCR检测H19的表达量。2.利用Lipofectamine 3000试剂转染用于敲低H19的Smart Silencer和相关阴性对照,转染后不同时间点提取RNA,qRT-PCR验证敲低效果。3.利用qRT-PCR和Western Blot的方法检测过表达或敲低H19后相关分化指标RUNX2、OSX、ALP、BSP及OCN的含量变化。结果:1.慢病毒处理后的H19表达明显增高,而转染Smart Silencer后H19表达低于对照组,提示过表达与敲低均成功。2.H19过表达后,相关分化指标表达明显上调,而敲低H19使分化指标表达降低。结论:H19可以促进成牙骨质细胞的分化。第三部分lncRNA H19对成牙骨质细胞矿化、增殖能力的影响目的:通过过表达或敲低H19,探讨其对成牙骨质细胞矿化、增殖能力的影响。方法:体外培养OCCM-30细胞,按照前述方法过表达或敲低H19后,分别进行如下操作:1.矿化诱导14天后,进行茜素红染色,观察矿化结节形成的变化,拍照后用氯化十六烷基吡啶溶解矿化结节,于562nm波长下读取吸光度,半定量分析矿化结节的形成。2.矿化诱导培养4天后,用多聚甲醛固定,进行ALP染色。3.矿化诱导培养4天后,提取总蛋白,进行蛋白浓度测定后,利用碱性磷酸酶活性试剂盒检测ALP活性变化。4.96孔板中每孔均匀接种5000个细胞,分别在24、48、72、96小时进行MTS实验并于490nm波长下读取吸光度,以判断H19能否影响OCCM-30细胞的增殖能力。结果:1.H19过表达组的矿化结节形成明显增多,而敲低组远比对照组低,半定量结果同样显示H19能够促进矿化结节的形成。2.ALP染色结果与茜素红染色结果一致,过表达H19后ALP染色加深,而敲低H19可以使ALP染色变淡。3.ALP活性检测证明H19可以增强ALP活性。4.MTS实验表明不同处理组在相同时间点的吸光度值没有明显差异。结论:H19可以增强成牙骨质细胞形成矿化结节的能力,但对其增殖能力没有明显影响。