目的应用分子生物学技术研究和分析孕期大鼠镉暴露后,其子代成年大鼠卵巢颗粒细胞雌孕激素合成功能障碍中的作用及其调控机制,为进一步开展镉的生殖毒性和毒作用机制提供科学依据。方法选取SPF级成年SD大鼠,合笼受孕后,于妊娠第1-20天分别暴露于0、0.5、2.0、8 mg/kg CdCl₂,灌胃染毒,每天一次。F1代雌性大鼠于出生后第56天处死,取卵巢颗粒细胞稳定培养24h贴壁后收集细胞（10×10⁶个/ml）及上清液备用。再取成年后的F1代大鼠雌雄2:1合笼受孕,F2代雌性大鼠于出生后第56天时处死,取对照组（0 mg/kg）和高剂量组（8 mg/kg）的大鼠卵巢颗粒细胞稳定培养24 h,贴壁后收集细胞（10×10⁶个/ml）及上清液备用。1 F1代成年大鼠卵巢颗粒细胞激素合成基因的靶miRNA的筛选8 mg/kg染镉组的大鼠卵巢颗粒细胞培养24 h后,提取对照组和染镉组总RNA,制备基因芯片。对表达上调的miRNA的靶基因进行Gene Ontology（GO）和pathway分析;采用Miranda、mirbase、miRdb和TargetScan预测软件分析雌孕激素合成相关基因的靶miRNA,以及根据国内外相关文献筛选镉可能影响颗粒细胞雌孕激素合成相关的miRNA;将筛选出的可能影响孕期镉暴露F1代成年大鼠卵巢颗粒细胞雌孕激素合成的miRNA进行初步qRT-PCR验证。2 miR-27a-3p和miR-10b-5p在子代卵巢颗粒细胞中功能的研究2.1双荧光素酶报告系统验证miR-27a-3p对大鼠STAR基因的作用关系构建STAR-3’UTR双荧光素酶报告载体,转染荧光素报告载体和miRNA mimics NC,miR-27a-3p mimics的细胞,利用化学发光仪测定荧光素酶的活性。2.2镉暴露对沉默miR-27a-3p和miR-10b-5p的人卵巢颗粒瘤细胞株雌孕激素合成的影响（1）构建miR-27a-3p和miR-10b-5p沉默的COV434细胞株;（2）实验分五组,分别为空白组COV434组、COV434+CdCl₂组、COV434-NC+CdCl₂组、COV434-miR-10b-5p+CdCl₂组和COV434-miR-27a-3p+CdCl₂组,除去空白组其余四组同时20μmol/L的CdCl₂处理;（3）qRT-PCR测定各组细胞中STAR基因表达;（4）Western Blot测定各组细胞中STAR蛋白表达;（5）Elisa法测定CdCl₂处理COV434细胞雌二醇和孕酮的水平;3孕期镉暴露对F2代成年大鼠卵巢颗粒细胞激素合成的影响（1）Elisa法测定CdCl₂处理F2代成年大鼠卵巢颗细胞雌二醇和孕酮的水平;（2）测定孕期镉暴露F2代成年大鼠卵巢颗粒细胞雌孕激素合成相关基因STAR、CYP11a1、SF-1的表达水平（qRT-PCR法和Western Blot法）;（3）测定孕期镉暴露后F2代成年大鼠卵巢颗粒细胞中miR-10b-5p和miR-27a-3p的表达水平（qRT-PCR法）结果1 F1代成年大鼠卵巢颗粒细胞激素合成基因的靶miRNA的筛选基因芯片结果分析:miRNA表达谱中一共232个miRNA表达失调,111个miRNA表达量升高（FC≥1.5）,降低的有121个miRNA（FC≤0.67）;根据GO分析发现富集到3个与雌孕激素相关的生物过程,分别为细胞内雌孕激素受体信号通路,类固醇激素介导的信号通路和胆固醇代谢过程;根据pathway结果富集到4个与雌孕激素作用相关的通路分别为MAPK信号转导通路,孕酮介导卵母细胞成熟,雌孕激素信号通路以及PI3K-Akt信号通路。根据miRNA微阵列芯片表达谱的GO分析和Pathway分析,在线预测软件以及文献中筛选出10个与雌孕激素合成和作用通路相关的miRNA。分别为:miR-27a-3p、miR-10b-5p、miR-29a-3p、miR-22-3p、miR-148a-3p、miR-25a-3p、miR-30e-5p、miR-16-5p、miR-146a-5p、miR-92a-2-5p.qRT-PCR结果:与对照组相比,有8个miRNA发生了差异表达,其中0.5、2.0、8.0mg/kg染镉组miR-27a-3p表达水平上调,2.0、8.0mg/kg染镉组miR-10b-5p表达水平上调,具有剂量效应关系（P<0.05）。2 miR-27a-3p和miR-10b-5p在子代卵巢颗粒细胞中功能的研究2.1双荧光素酶报告系统验证miR-27a-3p对大鼠STAR基因的作用关系（1）结果显示与野生型miRNA NC+STAR-3’UTR相比,共转染miR-27a-3p+STAR-3’UTR的荧光素酶活性显著下降（P<0.05）;（2）与突变型miRNA NC+STAR-3’UTR相比,突变型miR-27a-3p+STAR-3’UTR的荧光素酶活性无显著变化。2.2镉暴露对沉默miR-27a-3p和miR-10b-5p的COV434细胞株雌孕激素合成的影响2.2.1测定STAR基因mRNA和蛋白表达水平COV434+CdCl₂组和COV434-NC+CdCl₂组相比,STAR基因mRNA和蛋白表达水平无统计学意义（P>0.05）;与COV434组相比,COV434+CdCl₂组STAR mRNA和蛋白的表达水平下降（P<0.05）;与COV434+CdCl₂组相比,实验组inhibitor+CdCl₂中STAR mRNA和蛋白的表达水平升高（P<0.05）。2.2.2测定CdCl₂处理COV434细胞雌二醇和孕酮的水平COV434+CdCl₂组和COV434-NC+CdCl₂组相比无统计学意义（P>0.05）;与COV434组相比,COV434+CdCl₂组雌二醇和孕酮水平下降（P<0.05）;与COV434+CdCl₂组相比,实验组inhibitor+CdCl₂雌二醇和孕酮水平水平升高（P<0.05）。3孕期镉暴露对F2代成年大鼠卵巢颗粒细胞雌孕激素合成影响与对照组相比,染镉组孕酮水平下降（P<0.05）,雌激素水平无统计学意义（P>0.05）;染镉组STAR和CYP11a1 mRNA表达升高,蛋白表达下降（P<0.05）,SF-1 mRNA、蛋白表达均下降（P<0.05）;染镉组miR-27a-3p和miR-10b-5p的表达水平升高（P<0.05）。结论根据以上结果,可得出如下结论:1.筛选出10个与孕期镉暴露F1代成年大鼠卵巢颗粒细胞雌孕激素作用通路及合成相关的miRNA。2.miR-27a-3p和miR-10b-5p可调控孕期镉暴露致F1子代成年大鼠卵巢颗粒细胞雌孕激素的合成。3.镉对于F2代的雌孕激素合成功能仍具有影响,miR-27a-3p和miR-10b-5p主要通过抑制STAR基因翻译过程来影响雌孕激素合成功能。