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铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl.)是一种重要的兰科植物,具有很高的药用价值和观赏价值,但人类过度采挖和破坏其生境,以及野生铁皮石斛繁殖周期长,繁殖率低,致其沦为濒危物种。本文以铁皮石斛为材料,在果荚保存及种子萌发、原球茎发生形态学过程、原球茎发生细胞学过程和调控原球茎原分生组织形成的NAC基因生物信息学分析这四方面工作进行了研究,以期成为保护铁皮石斛种质资源的重要手段,并对育种繁殖工作提供参考。主要实验结果如下: (1)在不进行超低温保存实验情况下,果荚最优的贮藏方式是表面消毒后置于4℃真空环境,可保存4个月,且种子萌发率可达90%以上。 (2)铁皮石斛正常种子为黄绿色,呈两端微尖的纺锤形,种皮中间有椭圆状的种胚,由几十个细胞组成。种皮为一层长形薄壁细胞,细胞透明,无内容物,其加厚环纹有一定的偏转角度。纺锤形状的种皮两端不同,一端较细尖,另一端则比较钝圆。种胚平均长度为180μm,宽度为120μm,种皮长度为400μm,宽度为120μm,种胚和种子长度比为22.2%。 (3)在铁皮石斛种子非共生培养过程中,25d左右突破种皮,原球茎顶端会出现一些绿色素积累,底端自胚内出现群体散射状吸收毛。一周后发育成圆球形,40d左右原球茎的顶端出现凹陷,随后凹陷处出现凸起并填满凹陷,凸起持续发育成为子叶,子叶侧翼再形成小沟,再历时一个月逐渐发育成椭球形,并有真叶从子叶对侧沟内长出,80d左右成为哑铃形,原球茎底端逐渐降解,90d左右出现了根,最后形成幼苗共需110d左右。 (4)原球茎纵横比的变化趋势主要受原球茎纵向和横向细胞分裂生长速率的影响,45天后以原球茎长度增加为主。果荚中端的种子活力最强,接种时所需单个果荚的种子数量远远低于果荚内种子含量时,应尽量选取位于中端的种子。光照对处于圆球期及以前的原球茎发生无明显影响,暗培养只延缓随后的发生过程,并能增加原球茎长度。 (5)通过常规石蜡切片技术,以处于不同形态阶段的原球茎为材料,研究了原球茎发生的细胞学过程,可分为种胚期(仅分生组织细胞分裂)、原球茎形成期(薄壁组织细胞也启动分裂)、原球茎成熟期以及原球茎退化等4个各具特征的连续发育时期,原球茎成熟期又分为原分生组织形成、茎尖分生组织形成、叶原基/维管系统形成及根尖分生组织形成期。 (6)对拟南芥、水稻、玉米、大豆、苜蓿等植物NAC转录因子在NAM结构域区间的氨基酸序列及基因组序列进行分析,根据氨基酸序列特征对NAC家族进行分组研究。