被子植物的雌蕊包括柱头、花柱和子房,柱头接受花粉并引导花粉管的生长,花柱是花粉管生长的通道,子房包裹着胚囊即雌配子体,胚囊由一个卵细胞、两个助细胞、一个含两个极核的中央细胞、三个或三个以上的反足细胞组成,是受精作用的场所。花粉进入助细胞后,释放两个精细胞,一个精细胞与卵细胞融合形成合子,进而发育成胚胎;另一个与中央细胞融合形成受精极核,进而发育成胚乳。因此,被子植物双受精的完成离不开柱头、花柱和胚囊。在拟南芥中,人们通过组织特异表达基因的筛选、雌蕊缺陷突变体的鉴定和研究,对雌蕊发育的分子调控机制有了深入的了解。类似的研究也在玉米中开始进行,研究者们发现多个雌配子体特异表达的基因在雌配子体发育和双受精过程中发挥重要的作用。然而,水稻是世界上最重要的粮食作物之一,雌蕊仅包含柱头和子房,与雌蕊相关研究非常少,雌蕊发育与双受精过程的分子调控网络依然未知。因此,我们利用转录组测序、子房染色透明、图位克隆、定量PCR和原位杂交等技术对突变体dst(defective stigma)进行了研究,获得了以下结果:1、利用转录组技术比较水稻野生型子房和柱头中的基因表达水平,鉴定了3531个雌蕊柱头优势表达的基因。通过GO分析,发现与细胞膜和授粉相关基因在柱头中富集表达,胞外区域相关的基因则较少表达,因此,我们推测水稻柱头可能主要通过细胞膜在花粉吸引、附着、萌发等方面发挥功能;而转运、定位、信息交流、刺激应答相关基因在柱头中的富集表达则暗示着分泌相关基因可能对花粉在柱头上萌发发挥重要的功能,对分泌相关基因的富集分析结果也证实了这一点。同时,通过GO分析和KEGG分析,也发现了次生代谢相关基因也在柱头中富集表达,推测柱头中存在大量的次生代谢物,这些代谢物对柱头的形成和功能的发挥具有重要意义。综上所述,我们推测在水稻授粉过程中,柱头细胞膜上的受体感应外界的花粉刺激信号,激活下游通路,使细胞分泌相关的效应因子(如次生代谢物),应答外界的刺激,最终使亲和花粉正常萌发。2、通过水稻野生型子房和柱头差异表达基因的分析,鉴定了 703个柱头特异表达的基因和1257个子房特异表达基因,分析这些基因在整个水稻生活史的表达情况,发现7个在柱头中特异表达,45个在子房中特异表达,推测这些基因可能在柱头或子房中发挥重要功能。同时,通过比较有胚囊子房与无胚囊子房(突变体dst子房)的基因表达水平,发现385个基因在突变体dst子房中下调表达,分析这些基因在柱头和子房中的表达情况,发现其中122个仅在子房中表达,推测这些基因可能在胚囊中优势或特异表达。进一步分析这些基因在整个水稻生活史的时空表达模式,结果发现大部分均在雌蕊中优势表达,其中14个仅在雌蕊中特异表达,这暗示着这些基因很可能在雌蕊中发挥重要的功能。随后,利用qRT-PCR和原位杂交技术对部分基因进行了验证,结果与转录组测序结果基本一致。此外,测序结果显示部分测序片段在已有的基因外聚集成簇,暗示这些位置可能存在新的基因。我们利用Cufflinks和CPC等软件对这些测序片段进行分析,最终鉴定了 102个新的蛋白编码基因,并利用半定量PCR技术验证了其中的6个。这些新蛋白编码基因的鉴定是对水稻转录组的补充和完善,并且也为新基因的发掘提供了一个有效的方法。3、我们获得了一个水稻突变钵dst(defective stigma),在性状分离实验中,发现突变体dst杂合体后代表型的分离比为3.04:1;突变体dst与中花11杂交后代的表型分离比为3.13:1,二者均接近3:1,所以我们判定突变体dst的表型是由单基因控制的隐性性状。通过PCR技术发现突变体dst的表型与T-DNA插入非共分离,推测突变体dst的表型不是由T-DNA插入导致的,而是自然突变产生的,因此,我们采用了图位克隆的方法来克隆DST基因。首先,通过突变体dst与中花11杂交构建了 F2代作图群体,分析SSR标记交换率,发现2号染色体上标记RM530的重组率为15.46%,远低于理论值50%,推测突变基因位于2号染色体上。同时,分析标记发生交换的植株,发现标记RM530和RM561发生交换的植株不同,因此我们认为DST基因位于标记RM530和RM561之间。为了验证这个结果,我们从2号染色体上选取了一些其余SSR标记进行分析,结果显示标记RM3688和RM3515的交换率分别为2.73%和4.55%,且两者发生交换的植株不同,推测DST基因位于这两者之间。随后,从标记RM3688和RM3515之间筛选其余标记并对标记发生交换的植株进行分析,发现标记RM13511和RM13517发生交换的植株不同,因此推测突变位点位于标记RM13517和RM13565之间。然后,对F2代作图群体进行基因组重测序,并分析标记的频率分布,发现DST基因位于RM13517和RM13565附近,这进一步确定了初定位的结果。之后,利用从基因组重测序的结果中筛选到SNP标记,分析了标记发生交换的植株,确定突变位点位于标记SNP21和SNP1之间的161Kb范围内,约包含20个左右的基因,具体是哪个基因发挥作用正在研究过程中。4、在无柱头突变体dst的生长过程中,观察发现基因DST的突变导致多种表型。在营养生长过程中,突变体dst的分蘖数较野生型少,推测DST可能参与茎侧生原基的发育。在突变体dst的花穗中,一次枝梗数、二次枝梗数和小穗数均较野生型的少,并且存在许多节不形成枝梗,而野生型的每一处节均生长着花穗枝梗或小穗,因此,推测这些节可能是未发育的花穗枝梗或小穗。对小穗进一步观察,发现突变体dst雌蕊和雄蕊的数目与野生型一样,但是突变体dst的雌蕊缺乏柱头;花药呈淡黄色且皱缩。利用I2-KI染色技术,发现突变体dst中花粉的败育率(5.15%)较低,花粉数目较少;然而,FDA染色结果显示突变体dst的花粉活力与野生型相似,,推测突变体dst花粉的发生异常,但能发生的花粉能正常发育。利用染色透明方法对突变体dst雌蕊的发育进行观察,结果显示突变体dst雌蕊原基的早期发育与野生型一致,但其心皮顶端无法分化形成柱头原基,从而导致突变体dst的雌蕊无法分化形成柱头。另外,对雌配子体的发育过程的观察结果显示突变体dst可以分化形成胚珠原基,但是在胚珠的发育过程中没有大孢子母细胞的形成,因此,水稻突变体dst的雌蕊缺失柱头和胚囊,这是一个良好的研究水稻柱头和胚囊基因调控的突变体材料。通过对柱头优势表达基因的转录组分析,在全基因组层面对柱头特化和发挥功能的分子基础进行了初步研究和分析,为后续柱头相关的研究奠定了基础;对于柱头/胚囊优势或特异表达基因的获得和分析也为解析柱头和胚囊发育的分子机制提供了极大的便利。另外,通过对水稻突变体dst的表型分析以及对DST基因的初步定位,我们既可以对柱头与大孢子母细胞发生的相关分子机制进行研究,也可以对DST基因在花穗发育过程中的调控机理和上下游通路进行研究,这对揭示水稻花穗和雌蕊发育的分子调控机制和调控网络具有重要意义,我们的研究为此奠定了良好的基础。