大口黑鲈肝细胞原代培养方法的建立及其应用于CYP450的诱导研究

来源 :上海水产大学 上海海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:blue_violet
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本论文从水产动物肝脏细胞的原代培养入手,筛选出一最适的肝脏组织,在此基础上建立一种稳定的肝细胞原代培养方法,将培养的原代肝细胞应用于药物代谢酶的诱导研究,以期为药物代谢酶的体外诱导研究奠定基础。 采用组织块法和消化法比较研究了草鱼、鳊鱼、鲫鱼、鲤鱼、鲈鱼、鲟鱼、(鱼回)鱼、甲鱼等水产动物肝脏组织的原代培养,其中消化法比较研究不同胰蛋白酶浓度及消化时间对细胞分离效果的影响,以消化的难易程度、消化所得细胞的数量及活力等参数为评价指标,最终筛选出鲈鱼肝脏为最适宜的肝细胞原代培养组织。进一步优化肝细胞的分离方法和培养条件,建立了在本实验室条件下大规模、长期培养原代肝细胞的方法。通过对肝细胞的培养上清液中LDH、ALb含量等指标的检测,确定了肝细胞功能表达的最佳时期,并将其应用于药物代谢酶的诱导研究。 结果表明:(1)肝脏组织的筛选;通过采用组织块法和消化法对草鱼、鳊鱼、鲫鱼、鲤鱼、鲈鱼、鲟鱼、(鱼回)鱼、甲鱼等水产动物肝脏组织原代培养的比较研究,组织块法均未见细胞从组织块中迁出,该法不适合肝细胞的原代培养;消化法分离肝细胞,其中鲈鱼肝组织获得最佳分离效果,0.25%胰蛋白酶消化20min,每克肝重可获得0.9×106个细胞,细胞活力达到89%,通过短期培养,初步判定鲈鱼的肝脏组织适于本实验室条件下体外分离消化,并可大规模培养。(2)鲈鱼肝细胞原代培养方法的建立;胰蛋白酶浓度0.25%,消化时间20min,分步收集肝细胞,经台盼蓝检测和血球计数板计数,平均活力>90%,每克肝重可获得3×106个分离肝细胞。在细胞活力和数量两方面达到最佳平衡。在含20%胎牛血清、10μg/mL胰岛素的M199/L15培养基中,于4%CO2,28℃培养箱中长期培养并可传代。(3)鲈鱼原代肝细胞损伤和代谢能力的检测;鲈鱼肝细胞在培养观察14d的过程中,在3-4d内LDH渗出量增加,随培养时间的延长,其分泌量呈下降趋势。白蛋白的分泌量在培养的3-5d中呈上升趋势,在4-8d维持一较高水平,此后,随着培养时间的延长,白蛋白逐渐减少。综合LDH渗出量、ALb分泌量的变化,选择培养至第5d的鲈鱼原代肝细胞应用于药物代谢酶的检测。(4)CYP450的诱导研究;取培养至第5d的鲈鱼原代肝细胞应用于CYP450酶系中的氨基比林-N-脱甲基酶的诱导研究,以利福平为诱导剂,氨基比林为底物,40μmol利福平诱导24h后,鲈鱼原代肝细胞中氨基比林-N-脱甲基酶活性最高,初步判定其由CYP3A4,CYP2C9介导。 随着人们对药物使用安全性的认识由以前的“靶动物安全,”到“食品安全”的转变,水产品药物(或污染物)残留问题已是国内外消费者关注的焦点,减少或消除药物残留是目前水产业发展亟待解决的问题。通过体外培养水产动物的原代肝细胞,将其应用于药物代谢酶的诱导研究,对了解药物在水产动物体内的作用机理和消除规律,进而对指导临床合理用药及药物残留监控有着重大意义。
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