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目的桥本甲状腺炎(桥本),又称慢性淋巴性甲状腺炎,是临床上甲状腺功能减退的最常见病因。现普遍认为甲状腺功能减退会影响患者的情绪表现。然而,近年来多项临床研究报告指出,即使甲状腺功能正常时,桥本也与情绪行为异常有关,尤其是抑郁和焦虑,但其机制不清。临床研究和动物实验证实神经系统慢性炎症与情绪障碍性疾病发生发展有关,在其中起着重要作用。因此,本研究拟建立甲状腺功能正常的桥本动物模型,并在此基础上观察桥本本身对小鼠焦虑和抑郁样行为的影响,同时观察额叶内相关的神经炎症事件,如小胶质细胞和星形胶质细胞激活以及相关炎性因子的产生等,旨在探讨甲状腺功能正常状态下桥本对情绪行为的影响及相关的神经炎性机制。方法雌性NOD小鼠20只,适应喂养7天后随机分为两组,即对照组和桥本组。通过甲状腺球蛋白联合佐剂两次尾部皮下免疫小鼠构建桥本动物模型。正常小鼠在相同的时间点单独佐剂皮下免疫作为对照组。第二次免疫4周后,利用旷场实验以及高架十字迷宫检测两组小鼠的焦虑样行为,强迫游泳和悬尾测试检测抑郁样行为。行为学检测结束隔天,下腔静脉采血,冰上取甲状腺和脑组织,分离出额叶。采用电化学发光免疫法和酶联免疫吸附实验检测各组小鼠血清中甲状腺炎相关参数水平。HE染色评估各组小鼠甲状腺病理。免疫组织化学法观察额叶内小胶质细胞和星形胶质细胞形态。透射电镜观察额叶内胶质细胞和神经元超微结构。实时RT-PCR检测额叶胶质细胞标记物(Iba1和GFAP)以及胶质源性炎症因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)的表达。TUNEL染色评估神经元凋亡。最后,利用实时RT-PCR和酶联免疫吸附法评估额叶内与炎症密切相关的5-羟色胺(5-HT)信号传导情况。结果1.甲状腺功能正常桥本模型建立:(1)体重情况:实验过程中对照和桥本两组小鼠的体重和体重增长速率没有差异。(2)甲状腺病理:对照组小鼠甲状腺滤泡完整,排列整齐,基本不可见单核细胞的浸润。而桥本小鼠甲状腺内可见明显的单核细胞浸润,而且伴有明显的甲状腺肿大,甲状腺滤泡的破坏,排列紊乱。进一步病理分级显示,与对照组小鼠比较,桥本小鼠甲状腺内单核细胞浸润程度明显加重(P<0.001)。(3)甲状腺炎相关参数血清水平:与对照组比较,桥本小鼠的血清Tg-Ab(P<0.001)和TPO-Ab(P<0.01)水平均显著升高,而两组小鼠的T3,T4和TSH血清水平无统计学差异。2.行为学结果:(1)旷场实验:与对照小鼠相比,桥本小鼠中央区进入次数降低(P<0.05),中央区停留时间也明显缩短(P<0.001);自主运动方面,两组小鼠总距离和平均速度没有统计学差异;直立次数方面,桥本小鼠较对照组明显降低(P<0.05);修饰次数方面,桥本小鼠也较对照组降低(P<0.05)。(2)高架十字迷宫:与对照小鼠相比,桥本小鼠开臂的总停留时间(P<0.05)以及进入次数(P<0.05)均显著降低。与此一致地,桥本小鼠开臂停留时间占比(%)(P<0.01)及其进入开臂次数所占百分比(P<0.05)亦较对照组相比明显降低。(3)强迫游泳:与对照组小鼠相比,桥本小鼠的不动时间明显延长,具有统计学差异(P<0.01)。(4)悬尾实验:桥本小鼠的不动时间较对照组相比明显延长(P<0.001)。3.小胶质细胞活化评价:(1)Iba1组织化学染色:与对照小鼠相比,桥本小鼠额叶内激活的小胶质细胞数目和Iba1阳性染色面积占比均显著升高(P<0.05,P<0.05);(2)RT-PCR:桥本小鼠额叶Iba1 m RNA表达较对照组显著升高(P<0.01)。(3)透射电镜:对照组额叶小胶质细胞核形态不规则,核内染色质边集,胞浆内细胞器稀少,偶见个别溶酶体。相比而言,桥本小鼠额叶内小胶质细胞核变大,核染色质边集明显,胞浆内溶酶体数量增加,出现了激活的溶酶体—次级溶酶体。4.星形胶质细胞活化评价:(1)GFAP组织化学染色:与对照小鼠相比,桥本小鼠额叶星形胶质细胞胞体变大,染色加深,统计分析显示激活的细胞数目和GFAP阳性染色面积占比均显著升高(P<0.001,P<0.01);(2)RT-PCR:桥本小鼠额叶GFAP m RNA水平较对照组显著升高(P<0.05)。(3)透射电镜:对照组小鼠额叶星形胶质细胞核内染色质呈典型的环状边集,胞浆内细胞器较少,含有少量线粒体,核糖体,和内质网等。相比而言,桥本小鼠额叶内,星形胶质细胞核变大,胞浆内细胞器明显增加,含有功能活跃的高尔基体、大量的线粒体以及内质网。5.炎症因子表达:与对照组小鼠相比,桥本小鼠额叶内炎症因子IL-1β和TNF-αm RNA水平显著上调(P<0.05,P<0.05),IL-6 m RNA水平有升高趋势(P=0.08)。6.神经元超微结构;对照组小鼠额叶神经元核膜光滑完整,核内染色质分布均匀。胞浆内细胞器丰富,含有大量的核糖体、线粒体、内质网等成分。桥本小鼠神经元超微结构特征与对照组相似,未见明显的超微结构损伤。7.神经元凋亡:(1)透射电镜:对照和桥本小鼠额叶内神经元均未见染色质聚集、核固缩、凋亡小体等典型神经元凋亡特征。(2)TNNEL染色:两组小鼠额叶内TUNEL阳性染色神经元无明显差异。8.5-HT信号通路变化:桥本小鼠色氨酸(合成5-HT原料)降解酶吲哚胺-2,3-双加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO1)和5-HT转运蛋白(serotonin transporter,SERT)的m RNA表达均显著高于对照组小鼠(P<0.05,P<0.01)。另外,与对照组相比,桥本小鼠额叶的5-HT浓度明显降低(P<0.05)。结论甲状腺功能正常状态下,桥本甲状腺炎诱发小鼠额叶内神经炎症反应,影响与炎症密切相关的5-HT信号通路,提示神经炎症可能参与桥本甲状腺炎情绪异常的神经调控。