精子介导转基因方法(sperm-mediated gene transfer,SMGT)是生产转基因动物的有效途径,具有简便、高效特点,但机制至今不明确。我们前期研究证明CD4分子在山羊精子内化外源DNA的过程中起主要作用,并利用酵母双杂交系统,筛选与CD4相互作用的新型侯选分子—CD320和RanBP9,且通过免疫共沉淀方法初步验证了CD4与CD320和RanBP9具有相互作用,同时证明CD320和RanBP9在睾丸中的表达水平较高。但这两个分子在精子转染外源DNA的作用研究仍是空白。由于动物精子是精子细胞经过变态、高度分化形成的一类细胞,不具有分裂增殖的能力,不利于基因功能的研究。因此,我们将研究对象转向了与精子有密切关系的精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)。SSCs是性别分化后,精子发生的最初细胞形式,是精子生成和雄性生育能力的基础,具有自我更新维持生殖细胞数量恒定和定向分化产生精母细胞的潜能,也是成年雄性动物体内唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。SSCs可塑性较强,在体外可重编程为胚胎干细胞样多能干细胞,也能被诱导分化为精子样细胞,因此成为基因工程和细胞工程的理想种子细胞。目前小鼠、人、牛等动物的SSCs体外培养研究已相对成熟,但是有关山羊SSCs的报道较少。本研究首先对山羊SSCs进行分离、纯化及鉴定,获得体外培养的山羊SSCs,然后分别转染外源CD320和RanBP9,从细胞水平探索CD320和RanBP9在山羊SSCs中的表达情况,为进一步研究CD320和RanBP9在精子转染外源DNA的作用奠定基础。主要研究结果如下:1.山羊SSCs的分离、纯化及鉴定。采集4月龄山羊睾丸,采用两步酶消化法分离睾丸细胞,差速贴壁法纯化获得单细胞悬液,纯化后的精原细胞用无饲养层、1%血清同时添加GDNF、LIF和bFGF的培养液培养在37℃、5%CO2培养箱中。观察细胞生长状态,且运用碱性磷酸酶、免疫细胞化学染色和RT-PCR 3种方法对培养细胞进行鉴定。结果显示,细胞培养到14 d时已经形成了明显的细胞克隆,传代培养后仍能形成细胞克隆,且克隆周围的杂细胞减少,细胞克隆传至第二代时,细胞克隆减少,梭型细胞增多。碱性磷酸酶染色显示不同时间段的细胞着色深浅不一样,而体细胞不着色;免疫细胞化学染色显示细胞克隆表达SSCs标记PGP9.5、PLZF,而体细胞不表达;RT-PCR证实细胞克隆中SSCs的特异性标记基因CD29、CD49f、PLZF、OCT-4和THY1的表达水平明显比体细胞高,而细胞凋亡基因P21在SSCs中的表达明显比体细胞低。明确了培养的细胞克隆为SSCs克隆,可以进行后续试验。2.CD320在山羊SSCs中的表达情况。设计引物,运用实时荧光定量PCR检测CD320基因在山羊SSCs中的表达水平,并构建山羊CD320基因的表达载体,检测CD320在293T细胞中的定位及山羊SSCs中的转染情况。RT-PCR显示CD320基因在山羊SSCs中的表达水平明显高于体细胞,差异极显著;细胞转染结果显示,CD320在293T细胞的细胞质中表达,在山羊SSCs的细胞克隆中表达,但是在SSCs传代培养后,并未见到CD320仍有表达。3.RanBP9在山羊SSCs中的表达情况。设计引物,运用实时荧光定量PCR检测RanBP9基因在山羊SSCs中的表达水平,并构建山羊RanBP9基因的表达载体,检测RanBP9在293T细胞中的定位及在山羊SSCs中的转染情况。RT-PCR显示RanBP9基因在山羊SSCs中的表达水平高于体细胞,但差异不显著。细胞转染结果显示,RanBP9在整个293T细胞中都有表达,在山羊SSCs的细胞克隆中表达。SSCs传代培养显示RanBP9表达于细胞质中,细胞增殖检测发现转染了RanBP9基因的山羊SSCs增殖比未转染的SSCs快。