关节滑膜组织的过度增生和对软骨的侵蚀是类风湿性关节炎（RA）关节软骨破坏和关节畸形的直接原因。为探讨滑膜组织过度增生和侵蚀软骨的机理，我们将类风湿性关节炎患者滑膜组织中成纤维样滑膜细胞（以下称滑膜细胞）进行体外培养和实验，研究RA滑膜细胞过度增殖和具有侵蚀性的细胞内机制。由于大多数蛋白酪氨酸激酶在细胞增殖和凋亡中是重要的信号分子，所以我们选择滑膜细胞内的蛋白酪氨酸激酶作为研究的出发点。 首先根据己知的蛋白酪氨酸激酶保守区设计简并引物，克隆滑膜细胞内的蛋白酪氨酸激酶mRNA的3’部分。通过序列测定和分析，发现滑膜细胞至少表达六种蛋白酪氨酸激酶，分别为血小板衍生生长因子受体A（PDGFRA）、胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）、Janus激酶1（JAK1）、TYK2、盘状结构域受体激酶（DDR2）和Lyn。RNA点杂交分析表明，PDGFRA、IGF-1R和DDR2在RA滑膜细胞中的表达水平高于骨性 第四 军医大学博士论文 关节炎（OA，用作对照）滑膜细胞，其它三种激酶的水平在两种细胞中未见差异。 DDRS是一类广泛分布的受体型酪氨酸激酶。目前研究认为，它们可能与细胞分 泌MMP－l、神经组织和腺体的发育、肿瘤细胞的转移及细胞增殖相关。它们分两型， 分别是DDRI和DDRZ。令人感兴趣的是，DDRs的配体是胶原，胶原对DDRZ的激 活可使细胞高表达基质金属蛋白酶．1（MMP．l）。那么 DDRZ是否在 RA关节病变中也。是重要的MMP－l的介导因索呢？同时，11型胶原在RA发病中一直受到关注，但确切 机制尚不清楚。那么，11型胶原是否通过DDRZ而成为MMP－！的重要诱导因素呢？ 沿着这条思路，我们对DDRZ在RA滑膜细胞病变中的作用做了进一步的研究。由于 OA细胞来源不足，后续的很多＿厂作是采用 NIH 3T3细胞进行的。 首先利用原位杂交技术和免疫组化技术观察了DDRZ在人膝关竹滑膜组织中的分 布。发现不仅滑膜细胞层表达DDRZ，滑膜下层很多细胞也表达DDRZ，但细胞型别 辨别不消；培养的RA滑膜细胞表达DDRZ，DDRZ主要分布干胞膜和胞浆。免疫印 迹（Western blotting）显示，RA滑膜细胞和 NIH 3T3细胞均表达 DDRZ，但只有 RA 滑膜细胞中的DDRZM活化的，NIH 3T3细胞中的DDRZ处于非活化状态。明胶酶谱 分忻显示，RA滑膜细胞培养上清中可检测到较高水平的 MMPI活性，而NIH 3T3细 胞和 OA滑膜细胞培养上清中均未检测到 MMP．1活性。11刑胜原刺激NIH 3T3细胞 后，N！H 3T3细胞培养上淌中可检测到低水平的 MMP－！，同时细胞内 DDRZ被活化。 这提示，RA滑膜细胞过分泌的MMP．l可能与其DDRZ处于活化状态相大；！！型肢原 可以诱导NIH 3T3细胞分泌MMP．l，同时诱导DDRZ活化，此时MMP－1的分泌可能 由DDAI介导。 为了进一步确实DDRZ在RA滑膜细胞过分泌MMPI 中的介导作用，必须使用 特异性DDRZ阻断剂。在没有商品化的小分子阻断剂的倩况下，我们尝试着表达了 DDRZ受体胞外区。我们选择了DDRZ胞外区的两个片段进行克隆表达，分别称DA 片段和 DB片段，他们分别相应于 DDRZ分于氨基端第 23个氨基酸残基到第 194个氨 基酸残基和第23个氨基酸残基到第293个氨基酸残基，不包含信号肽序列。通过RT． PCR方法将两片段从人肺癌组织中扩增出，并分别克隆入T载体，测序鉴定后分别亚 克隆到吓EX4T－l载体和pIG载体中。 分别将pGEX－4T－IDA和的EX4T十DB片段在大肠杆菌中进行表达。发现均有 表达，用谷眯甘肽亲和珠纯化可溶性部分，得到纯度达 85％以上的目的蛋白（GST．DA 和 GST－DB）。竞争结合抑制实验表明，GST－DB融合蛋白有阻断M型胶原与 DDRZ受 Dgan＂le’’t ofBtochen’ISYrr a，ld Moleer’lar Biblbel） ．4． 第四军医大学博士论文 体结合的功能。 将GST－DB加到有＊型胶原刺激的培养细胞中发现，RA滑膜细胞分泌MMP－l 减少，胶原刺激下的NIH 3T3细胞分泌MMPI也有减少。这进一步提示，DDRZ介 导＊型胶原刺激下的NIH 3T3细胞和RA滑膜细胞分泌MMP－Ill型胶原对滑膜细 胞的这种诱导作用在M关节软骨破坏中可能具有重要意义。。pIG载体是一种真核载体，它可使表达的目的蛋白在梭基端带上一个FC片段，FC 段的融合可使