论文部分内容阅读
研究背景鼻咽癌是一种发生于鼻咽粘膜上的恶性肿瘤,它的发病受环境、遗传等因素的影响,主要分布于我国南方省份及港澳台地区和一些东南亚国家及地区,存在明显的地域性及种族聚集性。受各种环境因素的影响、EB病毒的感染、遗传易感性及表观遗传学的改变等多方面原因的作用下,最终导致了一些关键的癌基因过表达以及抑癌基因表达下调或缺失等[1],使患者鼻咽粘膜出现病理性改变。病情不断加重后,癌前病变会发展为鼻咽癌,最终往往由于肿瘤细胞发生转移而导致患者死亡[2,3]。因此,探究其具体发病的机理,对于防治鼻咽癌和改善鼻咽癌预后是至关重要的,这需要众多学者们不断努力的奋斗和坚持。1999年,由本研究所姚开泰院士指导的黎仲奎博士发现了一个能抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和转移的肿瘤抑制相关基因NESG1,其官方名字叫CCDC19（NM012337.1）。并扩增和拼接出一段连续的全长大约1850bp的NESG1基因cDNA片段。虽然通过基因芯片分析,我们得到了很多NESG1基因介导的细胞信号通路,但还必须要找出能与其直接相互作用的关键靶点。因此本课题组曾开展NESG1蛋白相互作用的研究,并通过酵母双杂交实验筛选出VPS33B、ENKUR、CCDC65等几个可能与NESG1相互作用的蛋白,很遗憾的是最后验证出只有VPS33B能与NESG1相互作用。然而在对所收集的鼻咽癌病人标本进行Q-PCR的结果中,我们又意外地发现CCDC65表达下调,这使我们又再一次关注CCDC65这个基因。CCDC65（卷曲螺旋蛋白65）主要定位于人正常鼻咽上皮细胞纤毛和精子尾部[4,5,6],在鼻咽上皮它是一个有12个亚基组成的蛋白复合体N-DRC（连接蛋白—动力蛋白调控复合体）的关键结构元件[5,7,8];而在男性生殖系统中它是定位于精子尾部的一个睾丸发育相关蛋白NYD-SP28上[6]。CCDC65构成的蛋白及蛋白复合体主要负责纤毛运动、精子尾巴活动和精子获能等功能,而现时对其研究并不多,主要集中在CCDC65缺失突变后导致N-DRC和NYD-SP28结构异常,从而引发PCD（原发性纤毛运动障碍）,PCD主要导致慢性气道感染、男性不育和体态发育异常等疾病[4,5,6]。CCDC65在衣藻中存在同源蛋白FAP250（鞭毛相关蛋白250）,其同样是一个蛋白复合体DRC2的结构关键元件并构成了衣藻的N—DRC来控制衣藻的鞭毛运动[9]。因此衣藻在大多数人类CCDC65的研究中作为模式生物。此外,还有单独对衣藻鞭毛的研究指出鞭毛Tektin、RSPs、CCDC40和CCDC65的修饰酶在鞭毛重吸收时被磷酸化,从而激活了 CCDC40和CCDC65的甲基化通路,来促成基丝结构的解体[9]。虽然CCDC65并没有与NESG1存在直接的相互作用,但本研究组的王浩博士在前期通过对所收集的鼻咽癌病人标本进行Q-PCR分析,检测出CCDC65在鼻咽癌细胞中呈现为低表达。而鼻咽癌恶性程度高且容易侵犯邻近组织,因此我们选定CCDC65为研究对象,以探究其在鼻咽癌细胞的增殖和侵袭过程中所起的作用。研究目的1、建立稳定过表达和瞬转干扰CCDC65基因的鼻咽癌株和细胞功能实验2、研究CCDC65抑制鼻咽癌细胞增殖和游走侵袭的分子机制3、CCDC65蛋白相互作用的初步探索研究内容和方法1、建立稳定过表达和瞬转干扰CCDC65基因的鼻咽癌株和细胞功能实验①利用公司包装的慢病毒感染鼻咽癌细胞株5-8F和HONE-1,建立稳定过表达CCDC65的细胞株;采用Western blot和Q-PCR进行过表达效率的鉴定,筛选出稳定过表达CCDC65基因的鼻咽癌细胞②鼻咽癌细胞稳定过表达CCDC65后,MTT体外增殖实验分别检测处理组和对照组中细胞增殖的变化情况;③鼻咽癌细胞稳定过表达CCDC65后,使用平板克隆实验来检测处理组和对照组中细胞增殖的变化差别;④鼻咽癌细胞稳定过表达CCDC65后,使用EDU细胞增殖实验检测处理组和对照组中细胞增殖的变化;⑤鼻咽癌细胞稳定过表达CCDC65后,流式细胞仪检测细胞周期,对比处理组和对照组中处于S期细胞比例的变化;⑥鼻咽癌细胞稳定过表达CCDC65后,进行裸鼠皮下成瘤实验,检测细胞体外成瘤能力的改变,并取出肿瘤,记录肿瘤重量和体积;⑦鼻咽癌细胞稳定过表达CCDC65后,Transwell和Boyden细胞体外侵袭实验检测处理组和对照组细胞侵袭能力的变化。⑧鼻咽癌细胞稳定过表达CCDC65后,以划痕实验来检测处理组和对照组细胞侵袭能力的差异。⑨利用公司合成的siRNA,瞬时干扰CCDC65基因在鼻咽癌细胞株5-8F和HONE-1中的表达,采用Western blot鉴定其干扰效率。⑩对被siRNA干扰表达CCDC65后的鼻咽癌细胞株,进行细胞增殖和游走侵袭相关功能的回复实验,确认变化是由过表达CCDC65后引起。2、CCDC65对鼻咽癌细胞增殖和游走侵袭能力的影响及其分子机制①鼻咽癌细胞稳定过表达CCDC65后,使用Western Blot实验方法检测细胞周期相关蛋白的变化,寻找与CCDC65有关的调控周期的相关信号通路;②鼻咽癌细胞稳定过表达CCDC65后,Wester Blot实验检测细胞EMT相关蛋白的变化,寻找CCDC65调控细胞侵袭的相关信号通路。3、CCDC65蛋白相互作用的初步探索①将CCDC65-Flag融合质粒导入鼻咽癌细胞株,并用Wester Blot检测其表达效果。②对已导入融合质粒的鼻咽癌细胞株进行免疫共沉淀实验,并进行质谱分析。③根据质谱分析结果,对鼻咽癌细胞和已导入融合质粒的鼻咽癌细胞进行免疫共沉淀实验,验证其与MYH-9的蛋白相互关系。统计学分析:采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料结果用x±s表示。过表达CCDC65鼻咽癌细胞株对照组和处理组间比值、穿膜细胞数目、荧光定量PCR的2-△△Ct值等的比较采用两独立样本T检验;各细胞样本的瞬时干扰CCDC65表达的鼻咽癌细胞株对照组和处理组间比值、穿膜细胞数目等采用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较,如有显著性差异,则多重比较用Dunnett法;MTT和划痕实验结果分析采用Two-Way ANOVA;以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1、慢病毒感染和瞬转干扰5-8F和HONE-1细胞后,建立了稳定过表达和瞬转干扰CCDC65细胞株,以完成一系列细胞增殖和游走侵袭功能实验。①稳定过表达CCDC65后,MTT,平板克隆实验分别检测目的处理组和对照组中细胞增殖的变化,结果表明过表达CCDC65后,通过细胞内一系列的活动可以抑制鼻咽癌的增殖;②EDU、细胞周期实验检测显示,稳定过表达CCDC65后,处于G1期的细胞比例上升,S期的比例下降,细胞被阻滞在分裂间期,导致增殖能力减弱;③CCDC65干扰鼻咽癌细胞后,细胞增殖功能实验结果表明干扰CCDC65能增强鼻咽癌细胞的增殖能力;④裸鼠体内成瘤实验结果表明,过表达CCDC65后癌细胞在裸鼠皮下成瘤的重量和体积均减小,与空白对照组相比,在统计学上两组实验结果有差异（P<0.05）具有统计学意义,基本证实了过表达CCDC65抑制鼻咽癌细胞在体内的成瘤能力;⑤Transwell和Boyden检测稳定过表达CCDC65后,减弱了细胞的侵袭能力,表明CCDC65可以抑制细胞侵袭;⑥划痕实验检测稳定过表达CCDC65后,减弱了细胞的侵袭能力,表明CCDC65可以抑制细胞侵袭;⑦CCDC65干扰鼻咽癌细胞后,侵袭的功能回复实验结果表明干扰CCDC65能增强鼻咽癌细胞的侵袭能力;2、CCDC65在鼻咽癌中抑制癌细胞的增殖和游走侵袭能力的分子机制①Western blot检测稳定过表达CCDC65后,细胞周期相关基因PTEN、P21和P27 表达上调,CDK4、P-RB、CCND1、c-Myc、P-AKT、P-PI3K、AKT、PI3K和c-Jun表达下调,表明CCDC65可能通过PI3K/AKT和β-catenin信号通路来调节鼻咽癌细胞的细胞增殖能力;②稳定过表达CCDC65后,Western blot实验显示下调了 EMT相关基因N-cadherin、Slug、β-catenin等的表达,同时上调了 E-cadherin的表达;并且抑制了 PI3K/AKT信号通路中P-AKT、P-PI3K、AKT、PI3K等相关蛋白的表达,并上调了 PTEN的表达;提示CCDC65抑制侵袭的进程,可能是通过调控PI3K/AKT和β-catenin信号通路来实现的;3、CCDC65蛋白相互作用的初步探索①在导入CCDC65-Flag融合质粒后,质谱结果得分中鼻咽癌相关蛋白MYH-9得分较高;②免疫共沉淀初步验证出CCDC65与MYH-9存在蛋白相互作用;结论1.CCDC65能够抑制鼻咽癌细胞的增殖和游走侵袭功能。2.CCDC65通过调控PI3K/AKT和β-catenin信号通路来抑制鼻咽癌细胞的增殖和游走侵袭。3.初步证实CCDC65与MYH-9存在蛋白相互作用。本研究的创新之处:1.首次证实CCDC65能抑制鼻咽癌细胞的增殖和游走侵袭,并从其分子机制方面得到验证。2.目前初步证实CCDC65与MYH-9存在蛋白相互作用。