目的:心脑血管疾病(Cardio-cerebrovascular Disease,CCD)是全球范围内致死的首要原因之一。在我国,CCD患病率及死亡率仍处于稳步上升的阶段。动脉粥样硬化性心脑血管疾病(Atherosclerosis Cardio-cerebrovascular Disease,ACCD),如脑卒中、冠心病等是我国CCD最常见的疾病类型。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是所有ACCD的病因和共同的病理生理学基础。动脉粥样硬化是一种以影响大中型动脉内膜为主的慢性全身性炎症性疾病。通常,动脉粥样硬化潜伏期较长,且常同时存在多个血管床受累。早期的诊断和治疗可以减缓或阻止动脉粥样硬化恶化。因此,开发有效的早期动脉粥样硬化检测方法势在必行。随着医学研究的不断深入,基于外周血的诊断标志物检测引起了研究者的极大兴趣。近期研究表明,天然自身抗体的检测可能为AS相关疾病的早期诊断提供了一种新型、有效的方法。几乎参与动脉粥样硬化发病机制的各种细胞均可表达细胞因子,这些细胞因子可作用于多种靶点,发挥多种作用。肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)及IL-6等细胞因子通常发挥促进AS形成的作用;另一些细胞因子,诸如转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β),IL-10及IL-35等与调节性T淋巴细胞(T-regulatory cells,Treg)作用并抑制动脉粥样硬化形成。另外,血管内皮生长因子受体1(vascular endothelial growth factor receptors 1,VEGFR1)和VEGFR2是血管生成的重要调控因子,可能参与动脉粥样硬化形成的过程。以CD4+CD25+T细胞为特征的Treg细胞,可抑制动脉粥样硬化的形成和进展。CD25抗体消耗Treg细胞可促进动脉粥样硬化斑块的形成。Treg细胞特异性表达的FOXP3是Treg细胞最可靠的分子标志物之一,也是Treg细胞发育和发挥免疫抑制功能的主要调节因子。本研究旨在前期研究基础上,检测前述动脉粥样硬化机制相关因子的循环天然自身抗体,分析天然自身抗体的表达水平与动脉粥样硬化发生的相关性并探讨天然自身抗体作为动脉粥样硬化诊断标志物的可行性,旨在为AS的诊断提供实验证据及新的思路。方法:1、采集2017年1月-12月就诊于吉林大学第二医院神经内科的208例动脉粥样硬化患者的外周血及性别、年龄匹配的187例同期于吉林大学第二医院体检的健康人外周血。收集受试者性别、年龄、动脉粥样硬化患者的家族史、吸烟饮酒史及其他临床相关数据。2、根据NCBI数据库检索IL1α、IL1β、IL6、IL8、TNFα、CD25、FOXP3及VEGFR1氨基酸序列,通过生物信息学数据库和在线工具(http://www.iedb.org)设计线性多肽,委托上海吉尔生化公司合成多肽抗原并保证抗原纯度>95%。3、通过优化的酶联免疫吸附实验检测受试者外周血中天然自身抗体的表达水平。4、利用非参数检验分析天然自身抗体在动脉粥样硬化患者及健康对照受试者外周血中的表达差异及天然自身抗体表达水平与动脉粥样硬化患者临床病理特征的相关性,通过受试者工作曲线及曲线下面积评估天然自身抗体诊断动脉粥样硬化的能力,基于罗杰斯二元回归构建多指标联合诊断模型,利用Pearson相关系数评估各抗体之间表达量的相关性。P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果:1、基于NCBI数据库检索到的氨基酸序列,共设计并合成14条线性多肽抗原,各抗原序列如下:IL1α H-WETHGTKNYFTSVAHPNLFIATKQDYWVC-OHIL1β-1 H-SLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQG-OHIL1β-2 H-KHAYYSGNEDDLFFEADGPKQMKCH-OHIL6 H-LTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSC-OHIL8 H-DCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESD-OHTNFα-1 H-CQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLV-OHTNFα-2 H-KSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPK-OHCD25-a H-KPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVY-OHCD25-b H-IYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVE-OHCD25-c H-KHTSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCH-OHFOXP3-a H-DMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCD-OHFOXP3-b H-KCTFPNPSAPRKDSTLSAVPQSSYH-OHVEGFR1-a H-DEGVYHCKATNQKGSVESSAYLTVQGTSDK-OHVEGFR1-b H-CQITWFKNNHK IQQEPGIILGPGSSTD-OH2、天然自身抗体的表达水平Anti-IL1αIg G在动脉粥样硬化患者血浆中表达的水平为0.894±0.156;AntiIL1αIg G在健康对照受试者血浆中表达的水平为0.843±0.169。Anti-IL1αIg G在AS患者血浆中表达水平升高,且差异具有统计学意义,P<0.01;Anti-TNFα-1 Ig G在动脉粥样硬化患者血浆中的表达水平为1.238±0.304;Anti-TNFα-1 Ig G在健康对照受试者血浆中的表达水平为1.139±0.259。AntiTNFα-1 Ig G在AS患者血浆中表达水平升高,且差异具有统计学意义,P<0.01;Anti-VEGFR1-b Ig G在动脉粥样硬化患者血浆中的表达水平为1.498±0.449;Anti-VEGFR1-b Ig G在健康对照受试者血浆中的表达水平为1.568±0.390。AntiVEGFR1-b Ig G在AS患者血浆中表达水平降低,且差异具有统计学意义,P<0.05。3、Anti-IL1αIg G、anti-TNFα-1 Ig G及anti-VEGFR1-b Ig G诊断动脉粥样硬化的曲线下面积分别为0.578、0.592及0.564。利用罗杰斯回归构建3个天然自身抗体联合诊断模型,曲线下面积为0.651。根据性别因素,分别分析循环天然自身抗体在男性和女性群体中的表达情况,结果发现,与女性健康对照受试者相比,anti-IL1αIg G、anti-IL1β-2 Ig G及anti-TNFα-1 Ig G在女性动脉粥样硬化患者血浆中表达升高,其曲线下面积分别为0.618、0.588及0.650;与男性健康对照受试者相比,anti-VEGFR1-a Ig G及anti-VEGFR1-b Ig G在男性AS患者血浆中表达降低,其曲线下面积分别为0.578及0.594。根据年龄因素,分别分析循环天然自身抗体在低龄和高龄群体中的表达情况,结果发现,在低龄群体中anti-IL1αIg G、anti-IL1β-2 Ig G在动脉粥样硬化患者外周血浆中表达升高(P<0.05);Anti-TNFα-1Ig G在低龄与高龄两个群体的动脉粥样硬化患者外周血浆中表达水平均升高。4、Pearson相关系数显示各抗体表达量之间具有一定相关性,其中来源于同一个氨基酸序列的多肽抗原天然自身抗体表达相关性最高。非参数检验结果显示,循环天然自身抗体表达水平与动脉粥样硬化患者的甘油三酯水平、吸烟史、饮酒史、动脉粥样硬化斑块部位及大小等各项临床特征均无显著相关性。结论:1、动脉粥样硬化患者血浆中抗IL1α、抗TNFα和抗VEGFR1天然自身抗体(Ig G)水平显著高于健康对照组(P<0.05),ROC曲线下面积分别为0.578、0.592、0.564。提示血浆抗IL1α、抗TNFα及抗VEGFR1天然自身抗体(Ig G)有望成为动脉粥样硬化的生物学标志物。2、动脉粥样硬化患者血浆中抗IL1α、抗TNFα和抗VEGFR1天然自身抗体(Ig G)构建的联合诊断模型将诊断效能明显提高,ROC曲线下面积达0.651(P<0.01),将有助于提高动脉粥样硬化的诊断能力。3、女性动脉粥样硬化患者血浆抗IL1α、抗IL1β-2、抗TNFα-1天然自身抗体(Ig G)水平显著高于健康对照组(P<0.05),ROC曲线下面积分别为0.618、0.588、0.650。提示这三种天然自身抗体与女性动脉粥样硬化发病密切相关;在男性动脉粥样硬化患者血浆抗VEGFR1-a及抗VEGFR1-b天然自身抗体(Ig G)水平显著低于健康对照组(P<0.05),ROC曲线下面积分别为0.578及0.594。提示血浆抗VEGFR1天然自身抗体(Ig G)与男性动脉粥样硬化发病密切相关。抗TNFα-1天然自身抗体(Ig G)水平在女性患者外周血中水平高于男性患者(P<0.05)。4、年龄≤61岁动脉粥样硬化患者血浆抗IL1α、抗IL1β-2、抗TNFα-1天然自身抗体(Ig G)水平显著高于健康对照组(P<0.05),提示这三种天然自身抗体与年龄≤61岁动脉粥样硬化发病密切相关。年龄>61岁动脉粥样硬化患者血浆中抗TNFα-1天然自身抗体(Ig G)水平高于健康对照组(P<0.05),提示该抗体与年龄>61岁动脉粥样硬化发病密切相关。5、抗IL1β、抗IL6、抗IL8、抗CD25、抗FOXP3天然自身抗体(Ig G)在动脉粥样硬化患者组和健康对照组中的表达差异无统计学意义(P>0.05),不适合作为动脉粥样硬化的生物学标志物。