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哈茨木霉是一种重要的生防真菌,从基因水平研究木霉菌关键基因的功能,可以加速对其生长、生防、产孢机理的认识,为开发高效、稳定的生防制剂提供理论依据。利用分子标签技术获得突变子己成为功能基因克隆的有效方法,农杆菌介导的真菌遗传转化是当前获得突变子的最优方法之一。因此,本论文进行了农杆菌介导哈茨木霉转化体系研究,初步构建了哈茨木霉T-DNA插入突变体库,对突变子进行系统分析,取得如下结果:1.农杆菌介导哈茨木霉转化系统的优化及T-DNA插入突变体库构建针对转化过程中8个关键因素对农杆菌介导哈茨木霉转化效率的影响建立了高效的哈茨木霉转化体系:IM培养基中AS浓度为200μM,农杆菌诱导时间为6h,农杆菌菌液浓缩4~5倍与浓度为106个/mL的木霉孢子悬液等体积混合,400μL混合液涂布到含200μM AS、pH为5.3、铺有滤纸的共培养基上,24℃共培养48h。在该转化条件下农杆菌EHA105对哈茨木霉的转化效率为60~150个转化子/106个孢子。利用该转化系统构建了含有4500株转化子的突变体库,库中的转化子遗传稳定性高、转化子基因组中T-DNA插入拷贝数为1~3个,其中80%为随机单拷贝插入。2.哈茨木霉孢子产生突变子的筛选和分析采用PDA培养基、CHM培养基和PD培养基分别对突变体库中的920株、2680株和1192株转化子进行孢子产生突变体的筛选。利用PDA培养基筛选出8株孢子产生突变子,这些突变子与野生型哈茨木霉菌株相比,在孢子产生数量、菌落形态、分生孢子梗形态等方面发生了变异;利用CHM培养基筛选出4株厚垣孢子产生减少的突变子、3株厚垣孢子产生减少同时分生孢子产生增多的突变子;利用PD培养基筛选出12株孢子产生突变子,其中5株分生孢子产生减少,菌丝上没有厚垣孢子分化,另外7株分生孢子产生减少、菌丝上有厚垣孢子分化。3.哈茨木霉生长速度变异突变子和拮抗能力变异突变子的筛选和分析测定600株转化子在PDA培养基上的生长速度,得到3株生长速度降低的突变子,4株生长速度增加的突变子。测定1260株转化子对立枯丝核菌的拮抗能力,发现T-DNA插入对部分转化子的拮抗能力产生了明显影响,其中6株转化子拮抗作用增强,17株拮抗作用减弱。4.哈茨木霉T-DNA插入侧翼序列分析测定52株突变子右边界侧翼序列,得到42条可解析序列,其中7条为质粒序列、33条对应着单一序列、另外2条序列相同。34条序列进行分析发现,T-DNA插入过程中右边界序列存在一定程度的截短现象。另外,对34条序列的G+C%进行分析,其中92%的序列G+C%在44~56%之间(平均52.4%)。这与NCBI已公布的哈茨木霉EST序列G+C%含量相似,推断T-DNA插入到了哈茨木霉基因区。5.孢子产生突变子相关基因的克隆与序列分析利用TAIL-PCR方法对孢子产生突变子T-DNA右边界侧翼序列进行克隆,得到9条有效序列,将这些序列在Genbank中进行比对分析,发现有6株转化子的T-DNA右边界侧翼序列与已知基因具有同源性,推断了相关序列的功能。而其余3株转化子的侧翼序列没有找到同源基因,对其进一步分析有可能找到与孢子产生相关的新基因。