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第一部分:缺氧诱导胶质瘤干样细胞向血管内皮样细胞转分化。目的:通过体外缺氧诱导胶质瘤干样细胞(glioma stem-like cell,GSLC)转分化为内皮样细胞(glioma derived endothelial cell,GDEC),同时进一步检测胶该细胞在体外培养的性质和功能变化特点。方法:体外通过RFP+的SU3胶质瘤细胞系,通过无血清培养GSLC,后将GSLC在特定的转分化的培养基中,置于缺氧小室内进行缺氧(1.5%O2)培养48h。以培养HBMEC作为对照,观察细胞的形态学变化;利用免疫荧光标记技术对该细胞进行CD31和v WF内皮细胞表面标记物联合鉴定;通过Matrigel胶上进行三维培养,进一步考察该细胞形成血管管腔样结构的功能,同时应用透射电镜对细胞超微结构进行观察,比较该细胞器结构的差异;最后通过无血清培养探讨GDEC向GSLC逆向分化现象,以及明确在共同培养基中培养,检测内皮细胞标记物的变化情况。结果:1)缺氧条件下在转分化培养基中诱导GSLC48h,形态学上细胞分布由杂乱无章逐渐形成规则铺路分布,细胞形态由不规则结构转变成梭形内皮细胞样结构,同时能够阳性表达CD31及v WF内皮细胞标记物。2)GDEC具备正常内皮细胞性质,在Matrigel胶上能够形成典型血管腔样结构;与正常内皮细胞相比,GDEC具备更丰富的细胞器结构。3)转分化血管内皮细胞仍保留肿瘤细胞性质,在无血清培养下能较快逆分化成GSLC,而在含有内皮细胞培养基中则能长时间维持内皮细胞标记物稳定表达。结论:体外缺氧条件下,GSLC在转分化培养基中能够分化为具有内皮细胞性质和功能的血管内皮样细胞,它保留部分肿瘤细胞的性质,在不同培养条件下,能转变成不同类型的细胞。第二部分:基于肿瘤缺氧niche理念构建胶质瘤干样细胞与内皮细胞相互作用的在线分析模型目的:基于肿瘤组织缺氧niche理念,体外构建在缺氧条件下GSLC与内皮细胞之间相互作用在线分析模型,并探讨GDEC对GSLC作用。方法:结合HE和免疫荧光双染技术,证实脑胶质瘤组织缺氧区血管旁微环境的存在。基于相关病理参数基础上,利用PDMS通过“光刻法”制作微流控芯片,通过叠加组装形成上下层各有3条“L”型通道的微流控芯片,结合缺氧小室构建缺氧共培养系统。通过荧光报告系统和氧电极实时记录细胞相互作用的距离和氧气含量变化。应用死活试剂分析系统中GSLC、HBMEC、GDEC培养24h、48h、72h的存活情况;通过细胞荧光蛋白和免疫荧光标记技术追踪该系统中培养48h的GSLC、HBMEC、GDEC细胞原有标记物的变化;最后结合细胞荧光蛋白标记和细胞荧光追踪技术,将各种内皮细胞和GSLC接种在芯片上下层通道内,构建单独培养GSLC、HBMEC和GSLC共培养以及GDEC和GSLC共培养的三组在线分析模型,以前面两组作为对照组,分析缺氧环境中在GDEC作用下,GSLC细胞增殖情况。结果:1)缺氧小室和微流控芯片构建的缺氧共培养系统提供更靠近真实肿瘤微环境内皮细胞与GSLCs相互作用的平台。2)GSLC、HBMEC、GDEC缺氧共培养系统中培养24h、48h、72h呈现良好生长,利用选取培养48h以上各种细胞进行原有细胞标记物在线检测,结果表明以上各种细胞的原有标记物呈现稳定表达3)通过细胞荧光蛋白标记和细胞荧光追踪技术在线分析表明在缺氧共培养系统中GDEC具有更强促进GSLC增殖作用。结论:双层微流控芯片结合缺氧小室构成的缺氧共培养系统可有效应用于缺氧环境下细胞之间相互作用的研究,并成功模拟并证实缺氧下GDEC和GSLC之间的串话;同时结合细胞荧光蛋白标记和荧光追踪技术实现对细胞实时观察检测的功能。第三部分:缺氧下诱导胶质瘤干样细胞转分化的内皮细胞对胶质瘤干样细胞抵抗替莫唑胺的影响及分子机制目的:探索缺氧微环境中GDEC对GSLC抵抗TMZ作用的影响及分子机制方法:基于第二部实验搭建缺氧共培养在线分析模型的基础上,构建单独培养GSLC、HBMEC和GSLC共培养以及GDEC和GSLC共培养三组化疗共培养模型,在各组实验中添加2000μmmol/L的TMZ作用48h,以前两组作为对照组,每组设3个重复实验,通过激光共聚焦技术和流式细胞术分析在GDEC细胞作用下,GSLC存活和凋亡比例;最后在未加药的三组共培养模型中,通过Western-blot以及免疫荧光技术分析Jagged1、DLL4在与GSLC共培养前后GDEC表达情况,同时Elisa法检测三组共培养体系中共同培养基中Jagged1和DLL4含量;结合荧光定量PCR分析在GDEC作用下,GSLC细胞Notch信号下游Hes1激活情况。结果:1)缺氧共培养系统中三组实验,进行TMZ药物干预48h,有内皮细胞共培养下,GSLC的存活比例高,凋亡细胞少;其中,在GDEC作用下,GSLC存活比例最高,凋亡细胞最少。2)与GSLC缺氧共培养48h后,通过横向对比Western-blot以及免疫荧光结果,表明GDEC细胞表达更高的Jagged1和DLL4配体;同时通过纵向对比与GSLC共培养前后,GDEC细胞上Jagged1/DLL4蛋白表达上调。Elisa结果表明在与GDEC共培养共同培养基中的Jagged1和DLL4浓度含量最高。荧光定量PCR结果证实了在GDEC共培养下,GSLC细胞Notch下游基因Hes1上调表达最为明显。结论:缺氧微环境中,GDEC能够表达和分泌更高Notch配体(Jagged1、DLL4),激活更强的Notch信号通路,有效促进GSL增殖以及对TMZ抵抗。