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前言:癌症是指细胞异常或不受控制的增殖,一般可以根据细胞、组织、器官的来源命名。癌细胞能够通过淋巴或血液循环由原发部位扩散入侵远端组织,如果这种扩散能力没有受到控制或抑制,可能会造成致命的后果。结直肠癌是人类结肠和直肠的恶性疾病,其特征在于结肠上皮细胞异常增殖并跨越正常界限。在所有癌症中,结直肠癌的发病率在男性中居第三位,在女性中居第二位,全球每年大约有140万例。2016年结直肠癌死亡人数约69.39万人,占全年全球癌症死亡人数的8%。目前,手术切除、放化疗依然是治疗结直肠癌患者的常规手段。然而,随着手术疗法逐渐成为结直肠癌的主要治疗方式,术中麻醉药物的不当使用可能增加术后复发率,体内外研究表明许多麻醉药物可能与癌症的复发有关。结直肠癌切除术需要在肌肉松弛的状态下进行,以便于轻松和平稳地切除癌症部位。顺式阿曲库铵是一种被广泛应用的神经肌肉松弛剂,由于其能够使平滑肌足够松弛而不释放组胺。很多麻醉药物被发现会促进肿瘤生长和复发,近期研究显示顺式阿曲库铵抑制肿瘤的发展,然而其相关机制尚未明确。本研究将深入研究顺式阿曲库铵对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。尽管顺铂、5-氟尿嘧啶等化疗能够诱导肿瘤细胞死亡并减小肿瘤体积,但仍然有许多癌症患者由于治疗失败导致复发而死亡。目前,彻底消除癌症细胞仍然是肿瘤科医生的难题,90%转移性癌症药物治疗失败与由化疗药物的耐药有关。因此,深入研究化疗药物的耐药机制对研发癌症新型药物治疗具有重要意义。因此,本研究也在体内外探究了顺式阿曲库铵对5-氟尿嘧啶所致的结直肠癌细胞毒性中的作用。方法:采用CCK-8细胞活性检测,克隆形成实验,彗星实验,caspase比色测定,流式细胞术,实时荧光定量PCR,蛋白印记等分子生物学技术研究顺式阿曲库铵对携带野生型p53基因的结直肠癌细胞的毒性作用,以及导致细胞活性和细胞存活发生抑制的下游分子通路。构建稳定过表达野生型p53的HCT116细胞体外模型（St-p53 HCT116）,随后使用探针初步检测顺式阿曲库按对三种结直肠癌细胞模型的敏感性。采用细胞活力、致瘤性检测等方法研究顺式阿曲库铵诱导的p53过表达及其下游分子基因和蛋白对细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和耐药性的影响。对照组为空白对照（未暴露于顺式阿曲库铵）的St-p53 HCT116细胞,实验组分别采用10μM和20gM顺式阿曲库铵处理。结果:三种结直肠癌细胞的敏感性评估表明,与突变型p53 HCT116和缺失型p53HCT116细胞相比,St-p53 HCT116细胞对顺式阿曲库铵具有高度敏感性。与突变型p53 HCT116和缺失型p53HCT116细胞相比,不同浓度的顺式阿曲库铵（10μM和20μM）刺激下St-p53 HCT116细胞中p53 mRNA和蛋白质的表达水平均显著升高。St-p53 HCT116细胞对顺式阿曲库铵的敏感性及其诱导的p53表达上调作用均具有浓度依赖性。CCK-8细胞增殖检测,克隆形成实验,trans-well迁移,侵袭和划痕实验证实,与未处理的细胞相比,顺式阿曲库铵诱导p53过表达可以明显抑制其增殖、迁移、侵袭。此外,顺式阿曲库铵处理的St-p53 HCT116细胞生长在G1期受到明显抑制。对照组中未处理的St-p53 HCT116细胞处于G1,S和G2期的细胞数分别为 46.84±0.47%、44.12±0.92%和 9.04±0.98%,而用 10μM和20μM顺式阿曲库铵处理St-p53 HCT116后处于G1期,S期和G2期的细胞数分别为 59.82±0.90%、28.78±1.28%、11.4±1.30%和 78.31±1.69%、14.09±1.01%、7.6±0.90%。与未处理的细胞相比,用顺式阿曲库铵处理后过度表达 p53 的 ST-p53 HCT116 细胞中 p21、cyclin D1、cyclin E1 和 E2F 均下调。而与未处理的细胞相比,顺式阿曲库胺处理后的短暂时间内能观察到p21表达增加。这一结果提示基因组损伤可能与细胞生长阻滞有关。顺式阿曲库铵不仅能够促进癌症细胞的凋亡,这一现象还具有显著的时间和浓度依赖性。顺式阿曲库铵处理后St-p53 HCT116细胞的早期和晚期凋亡率分别为19.99±1.3%和30.34±1.16%,而未处理的St-p53 HCT116细胞24小时内的凋亡率为9.49%。未处理的St-p53 HCT116细胞、顺式阿曲库铵处理的St-p53 HCT116细胞（10μM和20μM）24小时后细胞凋亡率分别为 10.28±1.27%,27.31±0.33%和 47.12±1.09%。未处理的 St-p53 HCT116细胞、顺式阿曲库铵处理的St-p53 HCT116细胞（10 μM和20 μM）72小时后的细胞凋亡率分别为11.93±1.92%,42.59±1.19%和86.76±2.68%。与未处理的St-p53 HCT116细胞相比,顺式阿曲库铵处理后的St-p53 HCT116细胞中Bax和细胞色素C表达上调,并且伴有Bcl-2下调,且具有浓度依赖性。此外,切割的PARP产物仅在顺式阿曲库铵处理的St-p53 HCT116细胞中表达。顺式阿曲库铵处理后的St-p53 HCT116细胞中Caspase-9和Caspase-3活性显著升高,且具有浓度依赖性。总之,上述结果表明细胞凋亡可以通过p53依赖性内在凋亡途径介导。此外,trans-well迁移实验、划痕实验、qRT-PCR和蛋白印迹等结果表明,顺式阿曲库铵处理后的St-p53 HCT116细胞SNAI-1和SLUG表达下调,E-钙粘蛋白和CALD1表达上调,并且具有浓度依赖性。以未处理的St-p53 HCT116细胞中的SNAI-1,SLUG,E-钙粘蛋白和CALD1mRNA转录水平为标准,平均倍数变化都设为1。因此,顺式阿曲库铵处理后细胞（10μM和20 μ M）中SNAI-1,SLUG,E-钙粘蛋白和CALD1mRNA转录水平的倍数变化均归一化为β-actin,相对于未处理组其倍数变化分别是:SNAI-1为0.6和0.17,SLUG 为 0.58 和 0.16,E-钙黏着蛋白为 3.37和 4.17,CALD1的2.12和3.66。与单独使用5-FU相比,联合使用顺式阿曲库铵和5-FU治疗St-p53 HCT116细胞之后CCK-8细胞活力下降,细胞生长明显受抑制。与未处理的St-p53 HCT116相比,分别采用5-FU,5-FU/10μM顺式阿曲库铵和5-FU/20μM顺式阿曲库铵对St-p53 HCT116细胞处理24小时后的细胞生长抑制率为28%,43%和66%。与未处理的St-p53 HCT116相比,分别采用5-FU,5-FU/1OμM顺式阿曲库铵和5-FU/20μM顺式阿曲库铵对St-p53 HCT116细胞处理48小时后的细胞生长抑制率增加至35%,61%和86%。与对照相比,分别采用5-FU,5FU/10μM和5-FU/20μM顺式阿曲库铵处理后72h细胞生长抑制率出现压倒性显著差异,分别为56%,89%和94%。结论:顺式阿曲库铵在结直肠癌细胞中能够诱导DNA损伤,导致细胞周期停滞,细胞活力衰退,迁移和侵入能力下降,并可以通过p53信号通路促进细胞程序性死亡。联合5-FU和顺式阿曲库铵对结直肠癌细胞具有协同抑制治疗作用,这一发现将进一步探索如何规避5-FU靶向治疗耐药。因此,基于对麻醉技术不引起肿瘤切除术后复发需要足够的肌松或持续机械通气的深入研究,这些发现有很大的前景。