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【研究目的】:肝细胞内的葡萄糖代谢不仅对维护肝细胞及血液葡萄糖内环境的稳定,而且对维持运动技能的稳定发挥起着至关重要的作用。仅一次耐力运动训练就会引起肝细胞内糖原浓度发生巨大改变。为了维持肝糖内环境稳定,这种改变就必然会引起肝细胞对葡萄糖应激性需求剧增而向肝细胞转运大量葡萄糖,但关于肝细胞葡萄糖转运的研究一直较为薄弱。因此弄清机体应对或调节运动性应激事件所引起的肝糖原浓度变化的分子机制对于理解肝脏的生理功能以及提高运动体能具有十分重要的意义。机体内的其他细胞,无论是骨骼肌还是心肌细胞,尤其是运动过程中骨骼肌收缩引起其对葡萄糖的应激性需求,其细胞内葡萄糖浓度的调控均是由GLUT4蛋白完成。尽管转运蛋白家族成员很多,但有且仅有GLUT4具备在应激条件时转运葡萄糖的能力。而在剧烈运动过后的肝糖原恢复阶段机体也需要应激性地向肝细胞转运大量葡萄糖且发现在肝脏内Hep G2细胞中GLUT4有所表达。因此本人推断在运动所致肝细胞应激性肝糖恢复阶段,其所需葡萄糖是由GLUT4所完成的且采用了与骨骼肌类似的机制。本研究首次通过运动造模后给予不同的糖负荷刺激条件以模拟机体所应对葡萄糖突然间大幅度性波动变化环境从而探究GLUT4在肝细胞内的生物学功能以及肝糖原与GLUT4表达的对应情况并期待通过单一的模拟信号——“Caffeine诱导,探讨调控肝细胞内GLUT4的机制。从而为通过相应手段促进肝糖原快速恢复的能力从而维持稳定的运动表现提供理论依据。【研究方法】:实验一(即第二部分内容),验证肝细胞中GLUT4的应激特性。雄性SD大鼠(体重在165-185g)24只,按体重配对分成6组(对照18h组、禁食18h组、高糖18h组、高糖42h组、低糖42h组、低糖42h后转高糖24h组)。除对照18h组外剩余5组SD大鼠进行连续3天5%砝码负重、每天120min的游泳训练。训练结束后给予不同的饮食并在训练后的18h、42h、66h分批取材,用western-blotting生物检测技术测定各组大鼠肝细胞内总蛋白GLUT4蛋白表达水平、并利用硫酸蔥酮法测定各组肝糖原浓度。实验二(第三部分)利用Caffeine诱导,有效的避免了其他信号对实验结果的影响,以求研究调控GLUT4基因的机制。将购入的24只雄性SD大鼠,根据其体重大小“S”型分为4组---C2组、D2组、C24组、D24组,分别于注射液体后的2h、26h取肝组织,C2、D2组测定肝细胞内Ca MII磷酸化水平,C24组、D24组测定肝内GLUT4全蛋白含量。【研究结果】:实验一,(1)禁食18h肝细胞GLUT4总蛋白水平是高糖18h组的3.23倍(p=0.002<0.01);(2)低糖42h组肝细胞GLUT4总蛋白水平是高糖42组的5.6倍(p=0.001<0.01);(3)低糖42h组肝细胞GLUT4总蛋白水平是低糖42h后转高糖24h组的6.37倍(p=0.001<0.01);(4)高糖18h肝细胞糖原浓度是低糖18h组的2.31倍(p=0.004<0.01);(5)高糖42h组肝细胞糖原浓度是低糖42组的1.22倍(p=0.05);(6)低糖42h后转高糖24h组肝细胞糖原浓度水平是低糖42h组的1.3倍(p=0.05)。结果显示:各组GLUT4总蛋白水平与肝糖原浓度存在着反比关系即当肝糖原浓度较低时GLUT4存在高表达,而肝糖原浓度较高时GLUT4低表达。实验二,C24h肝细胞GLUT4总蛋白水平是D24组的2.95倍(p=0.002<0.01);C2h组肝细胞Ca MKII的磷酸化水平是D2组4.58倍(p=0.001<0.01)。结果显示C24h组大鼠肝细胞GLUT4总蛋白水平以及C2h组肝细胞总蛋白以及Ca MKII的磷酸化水平远低于对照组D24和D2组且都有统计学意义。【研究结论】:(1)GLUT4蛋白在肝细胞中具备类似于骨骼肌、心肌的应激转运能力,其能够在应激状态下的负责葡萄糖转运并在肝糖原的快速恢复过程中扮演着重要的角色(2)糖-对GLUT4基因的表达有十分强烈的修饰作用,在肝细胞内糖原浓度的变化可能作为上游信号以调节GLUT4基因蛋白的表达。(3)“Caffeine-Ca2+-Ca MKII”信号通路在调控大鼠肝细胞GLUT4蛋白表达过程中是存在的并且在调节控制肝脏内糖代谢的过程中发挥着至关的重要作用。