论文部分内容阅读
目的 通过研究慢病毒介导的核转录因子-κB诱导激酶和IκB激酶连接蛋白(NIK and IKKβ binding protein, NIBP)基因沉默后对人结肠癌细胞上皮-间质转化(EMT)的影响,初步探讨NIBP与结肠癌细胞侵袭转移的关系,以及可能涉及的机制。方法 利用DNA重组技术,进行设计并构建人NIBP基因的Lenti-EGFP-NIBP-miR慢病毒载体,以及无关序列的Lenti-EGFP慢病毒载体感染人结肠癌HCT116细胞株,并用杀稻瘟菌素(blasticidin, BSD)进行筛选稳定转染低表达NIBP的单克隆HCT116细胞,分别为转染组(NIBP-RNAi组)和阴性对照组(NC组),而未予转染处理的HCT116细胞则为空白对照组(CON组)。将实验分为非TNF-α组和TNF-α组两大组,非TNF-α组包括转染组(NIBP-RNAi) 、阴性对照组(NC)、空白对照组(CON), TNF-α组包括转染组+TNF-α(NIBP-RNAi+) 、阴性对照组+TNF-α(NC+)、空白对照组+TNF-α(CON+),根据文献及本课题组先前的实验结果,TNF-α组均予终浓度为20 ng/ml的NF-κB活化激活剂TNF-α进行干预。应用实时荧光定量-PCR及Western Blot技术检测非TNF-α组NIBP mRNA及蛋白的表达情况以及各组细胞中E-cadherin与N-cadherin的表达；采用倒置相差显微镜观察各组细胞形态的变化。结果 倒置荧光显微镜下可见NIBP-RNAi组及NC组有大量的绿色荧光蛋白。实时荧光定量-PCR及Western Blot均显示NIBP-RNAi组NIBP的表达均显著低于NC组及CON组(P<0.05)。实时荧光定量-PCR结果显示,各组E-cadherin mRNA的相对表达量为：NIBP-RNAi组(8.12±0.50)和NIBP-RNAi+组(4.11±1.65)均高于CON组(1.00±0.00)和NC组(1.04±0.05)(P<0.05),而CON+组(0.30±0.13)和NC+组(0.32±0.10)则明显低于CON组和NC组(P<0.05)；各组N-cadherin mRNA的相对表达量为：NIBP-RNAi组(0.18±0.08)和NIBP-RNAi+组(0.48±0.18)均低于CON组(1.00±0.00)和NC组(0.94±0.03)(P<0.05),CON+组(6.55±2.31)和NC+组(7.26±2.20)均高于CON组和NC组(P<0.05)。 Western Blot结果显示,各组的E-cadherin的蛋白表达量分别是：NIBP-RNAi组(1.30±0.11)和NIBP-RNAi+组(0.64±0.01)高于CON组(0.37±0.01)和NC组(0.34±0.02)(P<0.05),CON+组(0.18±0.02)和NC+组(0.18±0.01)均低于CON组和NC组(P<0.05);各组的N-cadherin的蛋白表达量为：NIBP-RNAi组(0.18±0.06)和NIBP-RNAi+组(0.34±0.01)均低于CON组(0.56±0.05)和NC组(0.47±0.13)(P<0.05),而CON+组(0.67±0.06)和NC+组(0.68±0.03)均高于CON组和NC组(P<0.05)。综上可知,与CON组比较,CON+组、NC+组细胞的E-cadherin的mRNA和蛋白的表达均明显降低、N-cadherin的mRNA和蛋白的表达均明显上升(P<0.05), NIBP-RNAi组及IBP-RNAi+组细胞的E-cadherin的mRNA和蛋白的表达均明显上升、N-cadherin的mRNA和蛋白的表达均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)；而CON组和NC组比较,以及CON+组和NC+组比较,E-cadherin、N-cadherin的mRNA和蛋白的表达差异均无统计意义(P>0.05)。经倒置相差显微镜可观察到CON+组、NC+组的细胞较CON组和NC组的细胞而言明显发生EMT变化,表现为细胞细长的丝状伪足增多,细胞间排列更疏松；NIBP-RNAi组的细胞则由间质细胞形态转变为上皮细胞形态,可见较多的多角形或圆形细胞,伪足明显减少,细胞连接紧密。结论靶向下调NIBP基因的表达可抑制人结肠癌HCT116细胞EMT的发生,这可能与NF-κB经典途径的激活受抑制有关。