论文部分内容阅读
单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus,HSV）的感染在临床上非常普遍,可引起多种疾病。HSV分为HSV-1和HSV-2两型。HSV-1感染角膜上皮,引发单纯疱疹性角膜炎,因其在眼科中发病率高、病情顽固、病程迁延、反复发作而严重的危害视功能,是当今世界上危害最重的至盲眼病,发病居角膜病的首位。HSV-2引起的生殖器疱疹,是目前临床常见的性病之一。HSV-2与宫颈癌、阴道癌、口腔鳞状细胞癌、唇癌等肿瘤发生有关系,还是导致TORCH综合征的病原体。妊娠期妇女感染HSV-2后,经胎盘感染胎儿,诱发流产、早产、死胎或先天性畸形。有效鉴别HSV两型,对疾病的诊断、治疗和病人的身心健康至关重要。随着HSV基因组学和表位学研究的深入,HSV-1和HSV-2的一些型特异性表位逐渐被人们认识,利用这些型特异性抗原表位建立对HSV-1和HSV-2鉴别诊断的方法,能提高HSV鉴别诊断的准确性。本研究拟通过DNA串联重组技术表达HSV-1型特异性表位抗原,并以重组表达的目的蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA检测HSV-1感染的血清学诊断方法。方法与结果1.合成2拷贝的HSV-1型特异性表位gG112-127基因片段,通过同尾酶串联重组技术分别得到含有4×、8×、16×、32×gG112-127的重组子,经酶切鉴定和核甘酸序列测定,结果与理论预测完全一致。2.构建的多拷贝串联重组子经IPTG诱导均得到一定量的表达,其中8×gG112-127重组子的表达量最高,其表达产物占菌体总蛋白的20.5%,目的蛋白主要以包涵体形式表达。包涵体蛋白洗涤初步纯化后,进一步采用离子交换层析纯化,得到了纯度为98.05%的目的蛋白。3.将HSV-1和HSV-2病毒颗粒SDS-PAGE后转印至硝酸纤维薄膜,以兔抗8×gG112-127血清作为一抗进行Westernblot,结果兔抗血清能与HSV-1病毒颗粒发生特异性抗原抗体反应,而不与HSV-2病毒颗粒反应;重组蛋白8×gG112-127SDS-PAGE后转印至硝酸纤维薄膜,分别以HSV-1、HSV-2感染的血清作为一抗进行Westernblot,结果显示其只与HSV-1感染的血清发生特异性抗原抗体反应,而不与HSV-2感染的血清发生反应。4.以纯化的8×gG112-127作为包被抗原建立并优化了检测HSV-1感染的间接ELISA:抗原的最佳包被浓度为5ug/ml;抗原最佳吸附方式为37℃,4h后转4℃过夜;待检血清稀释度为1:40;反应条件为37℃温育60min;5%脱脂奶粉作封闭液。以上述条件建立的ELISA对35份HSV-1感染的阳性血清和43份阴性血清进行检测,其敏感度为91.4%;特异度为97.6%;阳性预测值为96.9%;阴性预测值为93.3%;准确度为94.8%。同样,以此法对6份血清进行批间、批内三次重复性实验,显示其重复性良好。用本研究建立的ELISA方法与进口ELISA试剂盒同时对临床收集的100份待检血清进行检测,结果一致性为98%。结论:gG112-127是HSV-1型特异性抗原表位,本研究成功表达并获得了8×gG112-127的重组蛋白,此蛋白具有良好的抗原性和特异的免疫反应性,以重组蛋白建立的检测HSV-1感染的间接ELISA方法,初步应用表明有良好的特异性和一定的灵敏性。本研究为研发HSV感染鉴别诊断的血清学检测试剂盒奠定了理论和实践基础。