化学交联结合质谱技术(CXMS技术)是近年发展起来的一种研究蛋白质结构以及蛋白-蛋白相互作用的新方法。由于它比传统方法检测迅速、对样品纯度要求较低,并且可以确定蛋白相互作用的界面信息,因此得到科研人员的广泛应用。设计开发新型的化学交联剂一直是推动CXMS技术发展的重要环节之一,也是本论文的目标。在本研究中,通过与化学家的合作,我开发了两个系列的新型交联剂:一种是包含重氮基团的羧基交联剂(Diazoker);另一种是包含邻苯二甲醛基团的氨基交联剂(DOPA)。目前CXMS中最广泛应用的交联剂仅限于靶向氨基的NHS酯交联剂,由于它们主要靶向赖氨酸的侧链氨基和蛋白N端的氨基,因此获得的交联信息非常有限。而酸性氨基酸即谷氨酸和天冬氨酸在蛋白质中的比例总共占12.2%,并且酸性氨基酸属于极性氨基酸,大多分布在蛋白的表面或者蛋白的相互作用界面,因此,成功开发靶向羧基的化学交联剂将会大大扩大CXMS的应用范围。但是由于羧基在水溶液中表现出较弱的亲核能力,因此开发出在生理条件下具有较高选择性和反应活性的交联剂比较困难。本研究中,我们开发了一类包含重氮基团的羧基交联剂,我们称之为Diazokers(或统称为Diazoker),与之前报道的羧基交联剂PDH相比，Diazoker在反应时不需要加入缩合剂,并且在生理条件下具有比较高的反应活性和选择性。在充分优化了 Diazoker的交联反应条件后,我选择了具有15.6埃聚乙二醇中间臂的Diazoker 1作为代表。用九个标准蛋白样品进行测试,Diazoker 1在每个蛋白中平均鉴定到73对交联肽段对,与交联剂PDH相比,发现Diazoker 1鉴定的结果与晶体结构的吻合性更高。用更复杂的样品即十个标准蛋白的混合物检测Diazoker 1和PDH,分别鉴定到75和76对交联肽段对。经分析发现,Diazoker 1和PDH交联的酸性氨基酸位点有很好的互补性,Diazoker 1更倾向于交联相对较少暴露于溶剂中的酸性残基。Diazoker 1对现有化学交联剂进行了补充,丰富了 CXMS的分析工具。与常用的NHS酯交联剂如DSS和BS3一样,DOPA在生理条件下选择性地与赖氨酸残基反应。然而,DOPA具有两个独特的优点:一是不水解,二是具有更快的反应速率。我用具有微弱相互作用的蛋白复合物HPr/EIN和EIIA/EIIB作为研究模型,发现新交联剂DOPA2可以比DSS更好地固定微弱的或者瞬时的蛋白-蛋白相互作用。我还发现DOPA即使在低温、低pH值、高浓度变性剂如8 M尿素或者6 M盐酸胍存在下也能很好地进行反应。我用蛋白RINaseA作为研究模型,用新的交联剂DOPA2捕获到了蛋白变性过程中的结构变化信息。因此该工作不仅为CXMS鉴定弱相互作用蛋白提供了有力工具,并且将CXMS引入新的应用领域,比如蛋白质折叠或者去折叠过程中折叠中间体的研究。