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目的:目前我国的宫颈癌发病率和死亡率仍然居高不下。由于复发后不易手术、治疗手段非常有限,严重威胁着广大女性的生命安全。虽然,已经明确人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）高危亚型的持续感染是宫颈癌发病的重要因素,但仍然无法解释部分HPV始终阴性的宫颈癌患者的发病原因。宫颈癌虽然已经实现了三级预防,但在发展中国家宫颈癌依然是威胁女性健康的杀手之一,尤其对于HPV疫苗后时代的宫颈癌的发生机制的突破将成为妇科肿瘤领域消灭宫颈癌的最后一公里。环状RNA（circular RNA,circRNA）是近年来被研究发现的一类具有独特结构的RNA分子。作为一种具有闭环结构的分子,相比于线性RNA,circRNA不容易被RNA酶进行降解,在环境中更加稳定。因此,circRNA具有成为肿瘤标志物的潜力。近年来的研究发现多种恶性肿瘤中均可以检测出异常表达的circRNA,但是circRNA异常表达是如何引发肿瘤的具体分子机制亟需进一步的深入研究。某些circRNA被证明能够通过吸附mi RNAs阻碍其表达,进一步调控下游靶基因的表达,从而促进或者抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭转移。此外,有些circRNA被证明能够通过与RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）相互作用调控靶基因表达。在针对circRNA的作用机制的深入研究中,circRNA通过与蛋白结合调控复合物的机制近年来刚刚被关注,报道还不多,也是一个崭新的领域。本研究在前期芯片筛查到宫颈癌组织中异常高表达的circRNA的基础上,对circRNA调控宫颈癌发生发展的分子机制开展深入研究,旨在寻找出子宫颈癌发生发展的核心驱动机制。研究方法:首先结合前期芯片筛查结果,通过生信分析确定本研究的候选circRNA,进一步通过RT-q PCR实验在配对的宫颈癌及癌旁正常组织中进行检测,确定circZFR作为本研究的对象。在体外细胞实验中,首先通过基因重组技术,分别构建circZFR过表达和敲降的HeLa及SiHa稳转细胞系,通过CCK8实验、Ed U实验以及平板克隆实验来检测circZFR对于HeLa和SiHa稳转细胞系增殖能力的影响;采用细胞划痕实验以及Transwell小室实验来检测circZFR对于HeLa和SiHa稳转细胞系侵袭转移能力的影响;通过流式细胞术来检测circZFR对于HeLa和SiHa稳转细胞系细胞周期进程的调控作用。通过生信分析和RT-q PCR检测证明了E2F1转录激活是促发宫颈癌的关键信号通路,通过Western Blot实验检测过表达circZFR的宫颈癌HeLa和SiHa稳转细胞系中E2F1蛋白K117和K125两个位点的乙酰化程度以及Rb蛋白S807和S608两个位点的磷酸化程度,同时检测CDK2和cyclin E1两种蛋白的表达情况,并在配对的宫颈癌及癌旁正常组织中进行验证上述蛋白的表达情况。通过RNA pull-down实验及后续的蛋白质谱分析寻找能够与circZFR直接结合的RNA结合蛋白,同时利用circRIP实验进行反向验证circZFR与蛋白的结合作用。再通过免疫共沉淀实验检测circZFR对SSBP1/CDK2/cyclin E1蛋白复合物形成的调控作用。结果:1.根据课题组前期进行的3对宫颈癌及相匹配的癌旁正常组织进行的芯片筛查结果,结合从GEO公共数据库找到的另一套宫颈癌和癌旁正常组织的芯片结果,取交集,发现有6种circRNA在宫颈癌中异常高表达,其中只有circZFR是来源于外显子的circRNA。利用RT-q PCR实验对40例宫颈癌组织、30例癌旁正常组织以及7例正常宫颈上皮组织进行检测,结果表明circZFR在宫颈癌组织中异常过表达（P<0.001）。此外,通过circZFR预测宫颈癌的受试者工作特征（Receiver operating characteristic,ROC）曲线下面积可以达到0.88（P<0.0001）。通过对宫颈癌临床资料的分析,我们发现circZFR高表达与宫颈癌患者淋巴结转移密切相关（P=0.049）,并且与鳞状细胞癌相关抗原（Squamous Cell Carcinoma Antigen,SCC Ag）值和Ki67值呈显著正相关（P=0.049,P=0.003）。2.我们首先构建成功了circZFR过表达及敲降的HeLa和SiHa稳转细胞系。利用CCK-8实验、Ed U实验、平板克隆实验检测细胞增殖能力,结果表明circZFR过表达能够显著促进宫颈癌HeLa和SiHa稳转细胞系的增殖。此外,细胞划痕实验和Transwell小室实验的结果表明circZFR过表达能够显著地促进宫颈癌HeLa和SiHa稳转细胞系的侵袭转移。通过流式细胞术检测circZFR对于宫颈癌细胞周期的影响,结果表明circZFR过表达后处于G0/1期的宫颈癌HeLa和SiHa细胞比例显著降低,而处于S期的细胞比例显著增高。反之,敲降circZFR能够显著地遏制宫颈癌细胞的增殖、侵袭转移以及从G0/1期进入S期。3.通过对TCGA和GTEx数据库的生信分析发现宫颈癌组织中异常高表达的基因主要集中在DNA复制、细胞增殖及细胞周期进程这三个重要的信号通路,并且通过取交集找到14个关键基因。通过RT-q PCR实验验证出CCNB1、CCNA2、CDC25A、CDC6、TFDP1这5个基因的表达均受到circZFR的上调。我们通过查找公共数据库以及利用软件进行生信分析,成功找到了CCNB1、CCNA2、CDC25A、CDC6、TFDP1这5种基因的共同上游转录因子,其中包含在宫颈癌发生发展中发挥重要作用的E2F1。下一步Western Blot实验检测,证明了在宫颈癌细胞中过表达circZFR能够显著增加E2F1蛋白K117和K125两个位点的乙酰化程度,增加Rb蛋白S807和S608两个位点的磷酸化程度,同时增加CDK2和cyclin E1蛋白表达量。E2F1蛋白的乙酰化和Rb蛋白磷酸化程度增加、CDK2和cyclin E1蛋白表达量增加在30例配对的子宫颈癌和癌旁正常组织中也得到了证实,并且相关性分析结果表明circZFR表达量与Rb蛋白S807和S608两个位点的磷酸化程度以及E2F1蛋白K117和K125两个位点的乙酰化程度呈显著正相关。通过免疫共沉淀实验,我们发现当宫颈癌细胞中过表达circZFR,CDK2蛋白与Cyclin E1蛋白之间的结合作用显著增强,相反,当敲降宫颈癌细胞中的circZFR之后,CDK2蛋白与Cyclin E1蛋白之间的结合能力显著降低。进一步通过RNA pull-down实验及后续质谱分析,我们发现circZFR能够与SSBP1蛋白直接结合,利用circRIP实验反向验证了circZFR与SSBP1蛋白之间的结合作用。通过免疫共沉淀实验证明了宫颈癌细胞中过表达circZFR能够显著促进SSBP1蛋白与CDK2蛋白的结合作用,而敲降circZFR能够显著抑制SSBP1蛋白与CDK2蛋白的结合。结论:1.circZFR在子宫颈癌组织中异常高表达,并且与宫颈癌患者淋巴结转移、SCC值和Ki67表达具有较强的相关性。2.circZFR能够促进子宫颈癌细胞的增殖、侵袭转移和细胞从G0/1期进入S期。3.circZFR通过与SSBP1蛋白直接结合,促进SSBP1/CDK2/cyclin E1蛋白复合物形成,进而促进宫颈癌细胞中Rb蛋白的磷酸化以及E2F1蛋白的乙酰化。