李斯特菌属包括七个种,其中单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,以下简称Lm或单增李斯特菌)是能引起人畜共患病的食源性致病菌。单增李斯特菌为短小的革兰氏阳性无芽胞杆菌,能引起人的败血症、脑炎、脑膜炎和胃肠炎,在主要食源性致病菌中引起的死亡率最高。该菌在食品加工过程中可以通过多种途径污染食品,对消费者健康构成潜在威胁。在食品中发现任何一种李斯特菌都被认为是卫生状况不良。因此,建立敏感、特异的方法用于食品中李斯特菌属细菌的快速检测,对控制和提高食品的卫生质量具有重要意义。本实验室研制了李斯特菌种别检测试剂盒,通过多重PCR快速鉴别李斯特菌属细菌并区分单增李斯特菌毒力强弱。本研究优化该试剂盒后进行冻干,同时每个月进行特异性,敏感性及稳定性试验,结果表明冻干试剂盒具有良好的特异性,只有李斯特菌属细菌可以扩增出相应条带,而马链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血博代氏菌、大肠杆菌O157：H7等不能扩增出相应的条带。冻干试剂盒对单增李斯特菌的最低检测下限2.58×103CFU,而未冻干试剂盒的检测下限为102CFU。将冻干试剂盒用于人工污染牛奶的模拟试验,当牛奶中含有约1.43×102CFU/ml的Lm时可以通过直接预增菌6h检出。冻干试剂盒在-20℃保存八个月后依然保持稳定。本试验选择单增李斯特菌胞内感染相关毒力基因plcB和mpl为研究对象,设计其编码基因的特异性引物,PCR扩增目的片段后插入原核表达载体pET30a,重组质粒分别命名为pET30a-mpl和pET30a-plcB。重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,筛选阳性克隆,诱导表达并分析其产物。结果表明,plcB和mpl基因片段获得了融合表达。可溶性分析发现该蛋白以包涵体形式存在。以纯化的Mpl和PlcB蛋白作为包被抗原,鼠源抗单增李斯特菌全菌多抗作为一抗,ELISA和免疫印迹试验结果显示PlcB蛋白与全菌多抗具有良好的免疫反应性,而Mpl不能与抗Lm阳性血清反应。本研究为开发Lm PCR快速检测冻干试剂盒、建立基于PlcB蛋白抗体的免疫磁珠集菌方法提供了基础。