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柑橘是世界上广泛栽培且具有较高经济价值的重要果树。其常规杂交育种因受到珠心胚等因素干扰导致进程缓慢、效率不高;同时,珠心胚因含有母本全部遗传信息而具有固定优良性状的潜能。因此,珠心胚发生的分子机理研究将为柑橘育种提供重要理论依据。microRNA(mi RNA)是植物生长发育过程中的一类重要调控因子。本研究通过比较柑橘单胚与多胚品种胚珠miRNA表达水平差异,鉴定可能与珠心胚发生相关的miRNA,为深入探讨mi RNA介导调控珠心胚起始的内在机制奠定基础。另一方面,生物技术也是柑橘育种的重要途径,体细胞胚发生是获得离体再生植株的常见方式,是柑橘离体种质保存与生物技术育种的重要环节;柑橘多数品种的愈伤组织体胚发生能力随继代时间延长而逐渐减弱甚至丧失,一定程度上限制了柑橘生物技术与遗传改良研究的开展。基于前人研究基础,本研究以高度保守的miR156为候选关键miRNA,对其在柑橘体细胞胚发生过程中的潜在功能及相关调控机制展开深入分析。主要研究结果如下:1.小RNA高通量测序挖掘柑橘珠心胚起始相关miRNA以一对橘与一对柚/葡萄柚单胚/多胚品种为材料,选择珠心胚起始细胞出现前后两个时期,取胚珠进行小RNA深度测序。在橘胚珠中鉴定了91条已知的和60条新的miRNAs,预测的靶基因分别为695和163个;柚/葡萄柚中共鉴定了93条已知的及66条新的miRNAs,分别对应417和152个预测的靶基因。在一对橘品种的胚珠中两个时期均得到13个差异表达miRNAs,而柚/葡萄柚分别获得31和41个,仅有2个差异表达miRNAs(保守的miR1446a和新的miRN23-5p)在这两对材料的胚珠中都表现差异表达。实时定量PCR验证了其中6个差异表达的miRNAs,大部分与测序结果一致。基于前人的转录组测序数据,对其进行重新优化分析,获得305个共有的差异表达基因。Gene ontology(GO)分析表明逆境响应过程在上调基因中显著富集,进一步发现在该生物过程中大部分基因与氧化逆境响应相关,这些基因在两个多胚品种的胚珠显著高于单胚品种胚珠。因此,推测氧化逆境响应过程可能是影响柑橘珠心胚起始的重要因素。qRT-PCR分析表明,miRN23-5p在2个多胚品种6个胚珠发育时期的表达量均低于单胚品种,而其预测的2个靶基因表达模式恰好相反。烟草瞬时表达系统进一步表明,miRN23-5p能够剪切其中一个靶基因Cs9g06920,暗示miRN23-5p与Cs9g06920的互作可能参与珠心胚起始过程。2.csi-miR156a在体细胞胚发生过程中的功能验证及调控作用研究利用RACE技术获得csi-miR156a基因编码区CsMIR156A全长,扩增结果表明该序列在8个柑橘品种间无明显差异。将携带前体MIR156a的超量表达载体转入弱胚性的山金柑愈伤组织,并成功获得转基因愈伤组织系。体胚发生能力分析表明,转基因愈伤系的体胚发生能力明显高于野生型。qRT-PCR分析表明,2个靶SPL(CsSPL3和CsSPL14)在miR156超表达愈伤组织系中的表达相比野生型下调,且这2个靶SPL基因的表达模式与柑橘不同品种的体胚发生能力负相关,推测这两个SPL可能负调控体胚发生能力。亚细胞定位分析发现这两个SPL均定位于细胞核。转录激活实验结果表明CsSPL14有自激活现象,能够激活下游报告基因的表达;而CsSPL3没有自激活。构建CsSPL3和CsSPL14的RNAi载体,转化弱胚性的山金柑愈伤组织;经体胚诱导及体胚发生能力统计发现,与csi-miR156a超量表达愈伤组织系表型相似,山金柑CsSPL3和CsSPL14RNAi愈伤组织系的体胚发生能力均显著提高。利用数字表达谱分析比较超量表达mi R156的山金柑愈伤组织系与野生型,发现参与逆境响应及激素介导的信号转导途径等生物过程在上调基因显著富集,而下调基因主要参与甲基化及细胞周期等相关过程。qRT-PCR检测8个参与逆境响应过程差异表达基因的表达情况,表明这些基因在miR156超量表达与2个SPL基因干涉系均表现相似的表达模式。利用酵母双杂交筛库及点对点验证获得2个与CsSPL14潜在的互作蛋白,分别为CsARK1和SnRK催化亚基KIN10(CsAKIN10)。随后利用双分子荧光互补技术再次验证了以上互作关系。亚细胞定位分析表明Cs AKIN10定位在细胞核。综上所述,本研究鉴定了柑橘两对单胚/多胚品种胚珠中已知与新的miRNA,并发掘了可能与珠心胚起始相关的“miRNA-靶基因”调控组合;验证了csi-miR156a及其靶基因SPLs在体细胞胚发生过程中的功能,筛选了其中一个SPL的互作蛋白,并对SPL与其互作蛋白的相互作用调控体细胞胚发生的内在机制进行了讨论。