白细胞介素8(IL-8)是一种具有趋化作用的小分子分泌型炎症性细胞因子,属于CXC趋化因子家族的成员,又名CXC趋化因子8(CXCL8)。近年研究发现体内多种细胞如单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、角质形成细胞、肿瘤细胞等都具有分泌CXCL8的能力。CXCL8与其相应受体CXCR1结合后,除了对中性粒细胞有趋化和诱导其脱颗粒作用外,还可以通过促进血管形成、影响肿瘤细胞增殖、存活及运动,在肿瘤的发生、发展和转移中发挥重要作用。有研究表明CXCL8及其受体可激活或抑制角化细胞或内皮细胞增殖、血管生成及迁移等,在创伤愈合、缺血再灌注损伤(RI)、银屑病、癌症等疾病中修复组织损伤。本研究旨在通过RNA干扰技术,在肝癌细胞中转染特异性靶向CXCR1基因的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)序列,沉默CXCR1基因表达后观察肝癌细胞的增殖及侵袭能力变化,并检测其涉及的信号转导通路中相关蛋白的活性,进而了解CXCR1影响肿瘤发生和发展的分子生物学机制。此外,结合临床病理学资料进行统计分析,为肝癌治疗提供新的策略和理论依据。第一部分肝癌细胞中CXCR1的表达及干扰效果验证【目的】检测肝癌细胞及正常肝细胞中CXCR1的表达情况以及CXCR1-si RNA干扰效果的鉴定。【方法】通过蛋白免疫印迹实验检测正常肝细胞WRL68以及5种肝癌细胞系中CXCR1的表达情况;同样的方法检测3条CXCR1-si RNA的干扰效率。【结果】5种肝癌细胞中CXCR1表达水平相比较正常肝细胞WRL68明显增加;Hep G2细胞中CXCR1表达较其他肝癌细胞高,si RNA2干扰CXCR1表达效果最佳,可用于后续实验。【结论】肝癌细胞中CXCR1表达显著升高,我们成功筛选到一条CXCR1-si RNA可用于后续肝癌细胞生物学行为的研究。第二部分CXCL8/CXCR1信号轴对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭等能力的影响及其分子机制【目的】探讨CXCL8/CXCR1信号轴对肝癌细胞生物学行为的影响以及可能的分子机制。【方法】外源性CXCL8和/或CXCR1-si RNA刺激肝癌细胞后通过MTT、克隆形成实验、transwell实验、细胞划痕实验、流式细胞术和Hochest染色实验分别检测肝癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等生物学行为的变化;蛋白印迹检测相关信号通路蛋白的表达差异。【结果】MTT及克隆形成实验结果显示,外源性加入CXCL8能够促进肝癌细胞Hep G2增殖及细胞克隆形成能力,而沉默CXCR1基因后能够明显抑制细胞增殖及克隆形成;Transwell实验和划痕损伤实验的结果显示,外源性加入CXCL8能够增强细胞的迁移及侵袭能力,而干扰受体CXCR1的表达会明显抑制细胞的移动及侵袭能力。流式细胞术检测CXCL8/CXCR1信号轴对肝癌细胞凋亡的影响,实验结果显示,干扰CXCR1表达能够诱导Hep G2细胞发生凋亡。Hochest染色同样验证此观点,干扰组细胞核固缩甚至破碎,凋亡小体出现。蛋白免疫印迹实验结果显示,PI3K、Akt及NF-κB的磷酸化与CXCL8/CXCR1密切相关,外源性加入CXCL8可以激活PI3K/Akt/NF-κB信号通路,而转染CXCR1 si RNA后,PI3K/Akt/NF-KB通路中各主要成员蛋白的磷酸化水平被明显抑制。【结论】肝癌细胞中CXCL8/CXCR1信号轴可以通过激活PI3K/Akt/NF-κB信号通路影响其生物学行为,促进肝癌细胞存活以及发生侵袭转移。第三部分CXCL8/CXCR1信号轴在肝癌临床研究中的意义【目的】探讨反映肝癌发生、发展和转移的敏感指标,为肝癌的早期诊断及治疗、病程监控提供一定的客观依据。【方法】通过免疫组化检测CXCR1在肝癌及其癌旁组织标本中的表达情况;收集肝癌患者临床资料,将肝癌患者临床病理学资料结合CXCR1的表达情况进行相关性分析;对108例肝癌患者5年生存率进行Logistic回归分析。【结果】与对应的癌旁组织相比,CXCL8在肝癌中表达阳性率明显较高;进一步研究发现,CXCR1表达水平与肝癌患者的年龄,性别,是否有病毒感染,血清AFP含量,是否有肝硬化,肿瘤大小,肿瘤个数和是否肿瘤包膜完整等指标无相关性(P>0.05),与BCLC分期(P=0.006),TNM分级(P=0.017)和是否有血管侵犯(P=0.035)呈显著相关;CXCR1阳性患者相比较阴性患者其总生存率较低(P<0.05),无复发生存率也更短(P<0.05)。【结论】CXCR1与肝癌细胞的增殖、转移以及肿瘤组织的血管生成密切相关,CXCR1有可能成为临床上预后判断的指标之一。