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肺癌是世界上最常见的癌症相关死亡原因[1],其中肺鳞癌和腺癌是NSCLC(Non small cell lung cancer,NSCLC)最常见组织类型。肿瘤细胞发生癌基因激活,抑癌基因缺失,可导致细胞过度增殖,抑制细胞凋亡。肿瘤细胞间黏附改变,细胞骨架动力学变化,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解能力增强等方式促进肿瘤细胞突破基底膜,向组织内侵袭浸润,同时,肿瘤细胞还能向血管和淋巴管内迁移至机体其他器官定植和生长[2]。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是肿瘤细胞生长的外部环境,在肿瘤的形成和发展中发挥重要的作用,其中,肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)是肿瘤间质重要组成成分。CAFs可通过分泌细胞因子及重构ECM直接影响肿瘤生长,侵袭,转移,也可通过影响肿瘤相关免疫细胞,及血管内皮细胞间接影响肿瘤进展[3]。然而CAFs的功能具有异质性,例如CAFs中caveolin-1表达缺失与三阴性乳腺癌的预后差有关[4],而另一研究发现caveolin-1在CAFs中表达促进乳腺癌的侵袭和转移[5]。NSCLC单细胞转录组测序发现6种CAFs亚型,这些亚型在患者正常肺组织中少见[6]。CAFs可作为NSCLC复发和生存预后的预测指标[7]。可见,阐明NSCLC中CAFs特异的表型和功能将为NSCLC提供新的治疗靶点。
成纤维细胞是CAFs的主要细胞来源之一,其还可来源于骨髓来源间充质干细胞,周细胞,上皮或内皮细胞间充质转化(EMT)等。与正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NAFs)相比,CAFs分泌大量炎症因子,趋化因子,生长因子和ECM成分如胶原蛋白,纤连蛋白,糖蛋白等,其自身收缩能力,侵袭能力也显著增强[8]。成纤维细胞与肿瘤细胞相互作用在肿瘤的发生发展过程中有重要影响。其中肿瘤细胞诱导间质成纤维细胞表达CAFs的分子表型和功能,例如,肺癌细胞与NAFs共培养可教化NAFs表达一系列CAFs分泌的炎症因子,而这些炎症因子在促进肺癌生长中具有重要作用[9]。网膜成纤维细胞与卵巢肿瘤细胞通过TGFα-TNFα-EGFR(tumorgrowth factorα-Tumor necrosis factorα-epithelial growth factor receptor)途径相互作用促进卵巢癌腹膜转移[10]。因此,研究肿瘤与成纤维细胞间的相互作用的分子机制对阐明间质细胞对肿瘤发展影响仍十分重要。
SCRIB蛋白含有多个结构域,主要包括16个LRR(Leucine-rich repeats)结构域和4个PDZ结构域,它们能够结合多种类型蛋白如极化蛋白,黏附分子,信号分子蛋白,激酶等,因此,SCRIB参与多种细胞生物学过程如细胞极性,迁移,增殖,凋亡,侵袭等[11]。SCRIB可直接结合细胞信号分子或结合其他蛋白间接调控细胞信号通路活性如影响PI3K/AKT,Ras/MAPK,Hippo,WNT等信号通路。最早在黑腹果蝇生物体中发现,SCRIB的缺失诱导上皮细胞过度增生,被认为是抑癌基因。在哺乳动物中,SCRIB在乳腺,前列腺,肺上皮细胞中特异性表达缺失也与上皮结构组织紊乱相关[12-14]。在肺上皮细胞,SCRIB缺失联合KRAS突变明显促进肺腺癌的生长,并且肿瘤间质纤维化增加,巨噬细胞浸润增多,提示SCRIB的抑癌作用以及对TME的影响[13]。然而SCRIB对间质成纤维细胞功能的影响还不清楚。因此,在本文中,我们探讨了肿瘤细胞对成纤维细胞SCRIB表达的影响及其进而对肿瘤发展的影响及分子机制。
研究目的:
本文主要探讨了NSCLC来源CAFs中SCRIB表达与肿瘤进展的相关性,以及成纤维细胞中SCRIB表达对肺癌细胞功能的影响及其分子机制。
研究方法:
1)免疫组化检测SCRIB在临床肺鳞癌和腺癌组织间质成纤维细胞中表达情况,并根据患者临床资料做统计分析。
2)小鼠肺癌细胞LLC(Lewis lung cancer)与成纤维细胞共培养,蛋白质谱方法检测和分析共培养和单独培养成纤维细胞间差异性表达蛋白,荧光定量PCR(Quantitative-PCR,Q-PCR)检测共培养成纤维细胞SCRIB表达。
3)利用IncuCyte实时动态观察SCRIB敲低与对照组成纤维细胞增殖、迁移的差异;Transwell侵袭实验检测SCRIB敲低与对照组成纤维细胞侵袭的差异。
4)Western blot方法检测SCRIB敲低与对照组成纤维细胞中信号通路激活情况的差异;Transwell侵袭实验检测抑制SCRIB敲低与对照组成纤维细胞中相应信号通路对其侵袭能力的影响。
5)利用IncuCyte实时动态检测分别与SCRIB敲低及对照组成纤维细胞共培养的LLC增殖能力的差异;Transwell迁移和侵袭实验检测分别与SCRIB敲低或对照组成纤维细胞共培养的LLC迁移、侵袭能力的差异。
6)LLC-成纤维细胞皮下共注射移植瘤模型观察分别与SCRIB敲低或对照组成纤维细胞共注射的LLC肿瘤生长的差异;苏木精-伊红染色法(Hematoxylin eosin,HE)检测两组共注射早期肿瘤边缘肌肉浸润的情况。
7)转录组测序分析SCRIB敲低及对照组成纤维细胞之间差异性表达基因,并用qPCR及western blot方法检测SCRIB敲低及对照组成纤维细胞asporin(ASPN)表达情况。
8)siRNA抑制SCRIB敲低成纤维细胞ASPN表达,并用Transwell侵袭实验检测抑制SCRIB敲低成纤维细胞ASPN后对LLC侵袭能力的影响。
研究结果:
研究发现1)人肺鳞癌CAFs中SCRIB低表达与肿瘤分期晚,生存预后差相关,与淋巴结转移和临床分期无显著相关性。而人肺腺癌CAFs中SCRIB表达与肿瘤分期,淋巴结转移,临床分期均无显著相关性。2)与肺癌LLC细胞共培养的成纤维细胞SCRIB表达降低,LLC上清也能下调成纤维细胞SCRIB表达。3)SCRIB敲低成纤维细胞增殖能力稍减弱,侵袭能力明显增强。抑制PI3K/AKT信号通路能够减弱SCRIB敲低成纤维细胞侵袭。4)SCRIB敲低成纤维细胞对LLC增殖没有明显影响,而显著促进其迁移和侵袭。5)SCRIB敲低成纤维细胞对LLC肿瘤早期生长无明显影响,而促进了肿瘤细胞向邻近肌肉层的浸润。6)转录组学分析发现SCRIB敲低成纤维细胞ASPN表达增加,抑制ASPN减弱其促进LLC细胞体外侵袭能力。7)用数据库做ASPN转录因子预测分析,STAT5A是潜在调控ASPN的转录因子。SCRIB敲低成纤维细胞STAT5信号通路激活增加。
研究结论:
本研究结果表明,低表达SCRIB的成纤维细胞通过PI3K/AKT信号通路促进自身的侵袭,并能通过促进ASPN的分泌促进肺癌细胞体外侵袭。
成纤维细胞是CAFs的主要细胞来源之一,其还可来源于骨髓来源间充质干细胞,周细胞,上皮或内皮细胞间充质转化(EMT)等。与正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NAFs)相比,CAFs分泌大量炎症因子,趋化因子,生长因子和ECM成分如胶原蛋白,纤连蛋白,糖蛋白等,其自身收缩能力,侵袭能力也显著增强[8]。成纤维细胞与肿瘤细胞相互作用在肿瘤的发生发展过程中有重要影响。其中肿瘤细胞诱导间质成纤维细胞表达CAFs的分子表型和功能,例如,肺癌细胞与NAFs共培养可教化NAFs表达一系列CAFs分泌的炎症因子,而这些炎症因子在促进肺癌生长中具有重要作用[9]。网膜成纤维细胞与卵巢肿瘤细胞通过TGFα-TNFα-EGFR(tumorgrowth factorα-Tumor necrosis factorα-epithelial growth factor receptor)途径相互作用促进卵巢癌腹膜转移[10]。因此,研究肿瘤与成纤维细胞间的相互作用的分子机制对阐明间质细胞对肿瘤发展影响仍十分重要。
SCRIB蛋白含有多个结构域,主要包括16个LRR(Leucine-rich repeats)结构域和4个PDZ结构域,它们能够结合多种类型蛋白如极化蛋白,黏附分子,信号分子蛋白,激酶等,因此,SCRIB参与多种细胞生物学过程如细胞极性,迁移,增殖,凋亡,侵袭等[11]。SCRIB可直接结合细胞信号分子或结合其他蛋白间接调控细胞信号通路活性如影响PI3K/AKT,Ras/MAPK,Hippo,WNT等信号通路。最早在黑腹果蝇生物体中发现,SCRIB的缺失诱导上皮细胞过度增生,被认为是抑癌基因。在哺乳动物中,SCRIB在乳腺,前列腺,肺上皮细胞中特异性表达缺失也与上皮结构组织紊乱相关[12-14]。在肺上皮细胞,SCRIB缺失联合KRAS突变明显促进肺腺癌的生长,并且肿瘤间质纤维化增加,巨噬细胞浸润增多,提示SCRIB的抑癌作用以及对TME的影响[13]。然而SCRIB对间质成纤维细胞功能的影响还不清楚。因此,在本文中,我们探讨了肿瘤细胞对成纤维细胞SCRIB表达的影响及其进而对肿瘤发展的影响及分子机制。
研究目的:
本文主要探讨了NSCLC来源CAFs中SCRIB表达与肿瘤进展的相关性,以及成纤维细胞中SCRIB表达对肺癌细胞功能的影响及其分子机制。
研究方法:
1)免疫组化检测SCRIB在临床肺鳞癌和腺癌组织间质成纤维细胞中表达情况,并根据患者临床资料做统计分析。
2)小鼠肺癌细胞LLC(Lewis lung cancer)与成纤维细胞共培养,蛋白质谱方法检测和分析共培养和单独培养成纤维细胞间差异性表达蛋白,荧光定量PCR(Quantitative-PCR,Q-PCR)检测共培养成纤维细胞SCRIB表达。
3)利用IncuCyte实时动态观察SCRIB敲低与对照组成纤维细胞增殖、迁移的差异;Transwell侵袭实验检测SCRIB敲低与对照组成纤维细胞侵袭的差异。
4)Western blot方法检测SCRIB敲低与对照组成纤维细胞中信号通路激活情况的差异;Transwell侵袭实验检测抑制SCRIB敲低与对照组成纤维细胞中相应信号通路对其侵袭能力的影响。
5)利用IncuCyte实时动态检测分别与SCRIB敲低及对照组成纤维细胞共培养的LLC增殖能力的差异;Transwell迁移和侵袭实验检测分别与SCRIB敲低或对照组成纤维细胞共培养的LLC迁移、侵袭能力的差异。
6)LLC-成纤维细胞皮下共注射移植瘤模型观察分别与SCRIB敲低或对照组成纤维细胞共注射的LLC肿瘤生长的差异;苏木精-伊红染色法(Hematoxylin eosin,HE)检测两组共注射早期肿瘤边缘肌肉浸润的情况。
7)转录组测序分析SCRIB敲低及对照组成纤维细胞之间差异性表达基因,并用qPCR及western blot方法检测SCRIB敲低及对照组成纤维细胞asporin(ASPN)表达情况。
8)siRNA抑制SCRIB敲低成纤维细胞ASPN表达,并用Transwell侵袭实验检测抑制SCRIB敲低成纤维细胞ASPN后对LLC侵袭能力的影响。
研究结果:
研究发现1)人肺鳞癌CAFs中SCRIB低表达与肿瘤分期晚,生存预后差相关,与淋巴结转移和临床分期无显著相关性。而人肺腺癌CAFs中SCRIB表达与肿瘤分期,淋巴结转移,临床分期均无显著相关性。2)与肺癌LLC细胞共培养的成纤维细胞SCRIB表达降低,LLC上清也能下调成纤维细胞SCRIB表达。3)SCRIB敲低成纤维细胞增殖能力稍减弱,侵袭能力明显增强。抑制PI3K/AKT信号通路能够减弱SCRIB敲低成纤维细胞侵袭。4)SCRIB敲低成纤维细胞对LLC增殖没有明显影响,而显著促进其迁移和侵袭。5)SCRIB敲低成纤维细胞对LLC肿瘤早期生长无明显影响,而促进了肿瘤细胞向邻近肌肉层的浸润。6)转录组学分析发现SCRIB敲低成纤维细胞ASPN表达增加,抑制ASPN减弱其促进LLC细胞体外侵袭能力。7)用数据库做ASPN转录因子预测分析,STAT5A是潜在调控ASPN的转录因子。SCRIB敲低成纤维细胞STAT5信号通路激活增加。
研究结论:
本研究结果表明,低表达SCRIB的成纤维细胞通过PI3K/AKT信号通路促进自身的侵袭,并能通过促进ASPN的分泌促进肺癌细胞体外侵袭。