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目的：
肺纤维化(pulmonaryfibrosis，PF)是一种慢性弥漫性肺间质性疾病，其特征是基底膜和间质组织中细胞外基质蛋白的大量沉积，以及损伤的上皮细胞和肌成纤维细胞的增殖。肺纤维化患者临床表现为进行性呼吸困难，限制性通气功能障碍以及低氧血症等，最终会导致患者出现难以治愈的呼吸困难，患者大多死于呼吸衰竭。Notch信号通路是一种高度保守的信号传导通路，对细胞的增殖、分化、凋亡等过程起到调控作用，同时也是多种组织和器官早期发育必需的细胞间调节信号。近年来，越来越多的研究发现Notch信号通路与肺纤维化密切相关。本研究是在国家自然科学基金“化痰类中药多途径调节肺间质纤维化抗氧化机制的研究(编号：81273704)”的实验结果基础上，通过使用TGF-β1对MRC-5细胞进行造模，给予不同贝母组分(贝母甲素、贝母乙素、贝母辛和西贝母碱)进行干预，观察不同贝母组分对造模后MRC-5细胞氧化损伤的保护作用；同时使用DAPT阻断干预Notch信号通路，观察贝母组分保护MRC-5细胞以抗氧化损伤的具体作用机制。
方法：
1.MRC-5氧化损伤模型的构建及贝母组分最大无毒浓度的选择。
通过5ng/ml的TGF-β1对MRC-5细胞的不同作用时间，MTT法检测细胞增殖抑制率，Real-timePCR、WesternBlotting法检测不同作用时间的TGF-β1对MRC-5细胞内collagenⅠ、collagenⅢ的表达，ELISA法检测细胞内8-OHdG蛋白浓度的表达，选取TGF-β1造模的最佳作用时间。贝母组分对MRC-5的最佳无毒浓度，选取IC10为最佳无毒浓度，以备后续实验进行。
2.观察贝母组分对TGF-β1诱导的MRC-5细胞氧化损伤模型的保护作用。
分为空白组、模型组(TGF-β1组)、贝母甲素组(贝母甲素+TGF-β1)、贝母乙素组(贝母乙素+TGF-β1)、贝母辛组(贝母辛+TGF-β1)和西贝母碱组(西贝母碱+TGF-β1)，共6组。通过RT-PCR法检测并比较各组细胞中collagenⅠ、collagenⅢmRNA的表达；WesternBlotting法检测并比较各组细胞中collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA蛋白的表达；免疫荧光观察各组细胞中α-SMA的阳性肌成纤维细胞的数量及荧光表达强度。并筛选对MRC-5细胞保护能力较好、抗纤维化能力较强的贝母组分，进行后续具体抗纤维化及抗氧化损伤机制的探寻。
3.贝母乙素通过调控TGF-β1/Notch1信号通路介导的氧化损伤改善肺纤维化的机制。
分为空白组、模型组(TGF-β1组)、贝母乙素组(贝母乙素+TGF-β1)、TGF-β1+DAPT组和贝母乙素组+DAPT，共5组。通过WesternBlotting、RT-PCR法检测各组collagenⅠ、Ⅲ，Notch1-4、Jag1-2，Hes1和DLL1、3、4的蛋白及mRNA的表达并进行组内比较；ELISA法检测各组8-OHdG的表达水平；生化检测并比较各组SOD、GSH的表达；慢病毒转染Notch1目的基因至MRC-5细胞，检测贝母乙素用药后collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA和Notch1的蛋白表达。
结果：
1.MRC-5氧化损伤模型的构建及贝母组分最大无毒浓度的选择。
1.1选定以5ng/mlTGF-β1预刺激MRC-548小时进行氧化损伤造模的构建。
1.2TGF-β1不仅可以诱导MRC-5细胞产生氧化损伤，同时也使其产生纤维化损害。
1.3选定以贝母甲素3.125μg/ml、贝母乙素6.25μg/ml、贝母辛6.25μg/ml及西贝母碱6.25μg/ml作为该实验药物的最大无毒浓度，以备后续实验进行。
2.观察贝母组分对TGF-β1诱导的MRC-5细胞氧化损伤模型的保护作用。
2.1贝母甲素、贝母乙素、贝母辛和西贝母碱均可对TGF-β1所诱导的MRC-5细胞起到不同程度的保护作用，其中贝母乙素、贝母辛相对于其他的贝母组分而言，降低collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA纤维化因子的mRNA和蛋白表达量更明显，说明这两种贝母组分对TGF-β1所诱导的MRC-5细胞抗纤维化作用更强。
2.2贝母乙素组相较贝母辛组的α-SMA阳性肌成纤维细胞数量及荧光表达改善更为明显，说明贝母乙素对MRC-5细胞的保护作用更强，抗纤维化作用更明显，故选择贝母乙素作为后续实验药物。
3.贝母乙素通过调控TGF-β1/Notch1介导的氧化损伤改善纤维化的机制研究
3.1贝母乙素组+DAPT与TGF-β1+DAPT组之间Notch1、Jag1、Hes1的mRNA和蛋白表达无明显差异性，说明贝母乙素可能通过抑制Notch1、Jag1、Hes1的表达，降低信号通路下游因子的释放，起到保护细胞，减轻纤维化损害的作用；而在Notch2-4、Jag2、DLL1、DLL3及DLL4中无表达或表达无意义。
3.2贝母乙素可显著改善GSH和SOD的表达，减少8-OHdG的表达具有抗氧化作用；且DAPT+TGF-β1组可见GSH、SOD表达的上调，与贝母乙素组相比无明显差异性，说明贝母乙素可能通过阻断Notch信号通路起到抗氧化作用；同时贝母乙素组与DAPT+TGF-β1组相比，其collagenⅠ、collagenⅢ的蛋白和mRNA表达无明显差异，且较TGF-β1组明显减少，说明贝母乙素可能通过Notch信号通路抗氧化以减轻纤维化损害。
3.3转染Notch1病毒的MRC-5细胞内collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA、Notch1的蛋白表达明显上升，贝母乙素组MRC-5细胞内collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA、Notch1的蛋白表达明显降低，说明贝母乙素可以抑制Notch信号通路，降低通路下游产物表达，进而可以起到保护细胞，减缓FB向MFB的转化过程，对纤维化具有治疗作用。
结论：
1.TGF-β1可诱导MRC-5细胞产生氧化损伤，导致其纤维化产生。
2.给予最大无毒浓度的贝母组分均可使TGF-β1诱导的MRC-5细胞内降低纤维化因子的表达，说明安全浓度下的贝母组分可对氧化损伤的MRC-5细胞起到保护作用，减少纤维化损害。
3.贝母乙素可通过上调SOD、GSH的表达而发挥抗氧化、减少纤维化因子的产生的作用，其机制可能与Notch1/Jag1/Hes1信号通路有关。
4.贝母乙素可以通过抑制Notch信号通路，降低通路下游产物表达，进而起到保护细胞，减少氧化损伤，减缓FB向MFB的转化过程，对纤维化具有治疗作用。
肺纤维化(pulmonaryfibrosis，PF)是一种慢性弥漫性肺间质性疾病，其特征是基底膜和间质组织中细胞外基质蛋白的大量沉积，以及损伤的上皮细胞和肌成纤维细胞的增殖。肺纤维化患者临床表现为进行性呼吸困难，限制性通气功能障碍以及低氧血症等，最终会导致患者出现难以治愈的呼吸困难，患者大多死于呼吸衰竭。Notch信号通路是一种高度保守的信号传导通路，对细胞的增殖、分化、凋亡等过程起到调控作用，同时也是多种组织和器官早期发育必需的细胞间调节信号。近年来，越来越多的研究发现Notch信号通路与肺纤维化密切相关。本研究是在国家自然科学基金“化痰类中药多途径调节肺间质纤维化抗氧化机制的研究(编号：81273704)”的实验结果基础上，通过使用TGF-β1对MRC-5细胞进行造模，给予不同贝母组分(贝母甲素、贝母乙素、贝母辛和西贝母碱)进行干预，观察不同贝母组分对造模后MRC-5细胞氧化损伤的保护作用；同时使用DAPT阻断干预Notch信号通路，观察贝母组分保护MRC-5细胞以抗氧化损伤的具体作用机制。
方法：
1.MRC-5氧化损伤模型的构建及贝母组分最大无毒浓度的选择。
通过5ng/ml的TGF-β1对MRC-5细胞的不同作用时间，MTT法检测细胞增殖抑制率，Real-timePCR、WesternBlotting法检测不同作用时间的TGF-β1对MRC-5细胞内collagenⅠ、collagenⅢ的表达，ELISA法检测细胞内8-OHdG蛋白浓度的表达，选取TGF-β1造模的最佳作用时间。贝母组分对MRC-5的最佳无毒浓度，选取IC10为最佳无毒浓度，以备后续实验进行。
2.观察贝母组分对TGF-β1诱导的MRC-5细胞氧化损伤模型的保护作用。
分为空白组、模型组(TGF-β1组)、贝母甲素组(贝母甲素+TGF-β1)、贝母乙素组(贝母乙素+TGF-β1)、贝母辛组(贝母辛+TGF-β1)和西贝母碱组(西贝母碱+TGF-β1)，共6组。通过RT-PCR法检测并比较各组细胞中collagenⅠ、collagenⅢmRNA的表达；WesternBlotting法检测并比较各组细胞中collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA蛋白的表达；免疫荧光观察各组细胞中α-SMA的阳性肌成纤维细胞的数量及荧光表达强度。并筛选对MRC-5细胞保护能力较好、抗纤维化能力较强的贝母组分，进行后续具体抗纤维化及抗氧化损伤机制的探寻。
3.贝母乙素通过调控TGF-β1/Notch1信号通路介导的氧化损伤改善肺纤维化的机制。
分为空白组、模型组(TGF-β1组)、贝母乙素组(贝母乙素+TGF-β1)、TGF-β1+DAPT组和贝母乙素组+DAPT，共5组。通过WesternBlotting、RT-PCR法检测各组collagenⅠ、Ⅲ，Notch1-4、Jag1-2，Hes1和DLL1、3、4的蛋白及mRNA的表达并进行组内比较；ELISA法检测各组8-OHdG的表达水平；生化检测并比较各组SOD、GSH的表达；慢病毒转染Notch1目的基因至MRC-5细胞，检测贝母乙素用药后collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA和Notch1的蛋白表达。
结果：
1.MRC-5氧化损伤模型的构建及贝母组分最大无毒浓度的选择。
1.1选定以5ng/mlTGF-β1预刺激MRC-548小时进行氧化损伤造模的构建。
1.2TGF-β1不仅可以诱导MRC-5细胞产生氧化损伤，同时也使其产生纤维化损害。
1.3选定以贝母甲素3.125μg/ml、贝母乙素6.25μg/ml、贝母辛6.25μg/ml及西贝母碱6.25μg/ml作为该实验药物的最大无毒浓度，以备后续实验进行。
2.观察贝母组分对TGF-β1诱导的MRC-5细胞氧化损伤模型的保护作用。
2.1贝母甲素、贝母乙素、贝母辛和西贝母碱均可对TGF-β1所诱导的MRC-5细胞起到不同程度的保护作用，其中贝母乙素、贝母辛相对于其他的贝母组分而言，降低collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA纤维化因子的mRNA和蛋白表达量更明显，说明这两种贝母组分对TGF-β1所诱导的MRC-5细胞抗纤维化作用更强。
2.2贝母乙素组相较贝母辛组的α-SMA阳性肌成纤维细胞数量及荧光表达改善更为明显，说明贝母乙素对MRC-5细胞的保护作用更强，抗纤维化作用更明显，故选择贝母乙素作为后续实验药物。
3.贝母乙素通过调控TGF-β1/Notch1介导的氧化损伤改善纤维化的机制研究
3.1贝母乙素组+DAPT与TGF-β1+DAPT组之间Notch1、Jag1、Hes1的mRNA和蛋白表达无明显差异性，说明贝母乙素可能通过抑制Notch1、Jag1、Hes1的表达，降低信号通路下游因子的释放，起到保护细胞，减轻纤维化损害的作用；而在Notch2-4、Jag2、DLL1、DLL3及DLL4中无表达或表达无意义。
3.2贝母乙素可显著改善GSH和SOD的表达，减少8-OHdG的表达具有抗氧化作用；且DAPT+TGF-β1组可见GSH、SOD表达的上调，与贝母乙素组相比无明显差异性，说明贝母乙素可能通过阻断Notch信号通路起到抗氧化作用；同时贝母乙素组与DAPT+TGF-β1组相比，其collagenⅠ、collagenⅢ的蛋白和mRNA表达无明显差异，且较TGF-β1组明显减少，说明贝母乙素可能通过Notch信号通路抗氧化以减轻纤维化损害。
3.3转染Notch1病毒的MRC-5细胞内collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA、Notch1的蛋白表达明显上升，贝母乙素组MRC-5细胞内collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA、Notch1的蛋白表达明显降低，说明贝母乙素可以抑制Notch信号通路，降低通路下游产物表达，进而可以起到保护细胞，减缓FB向MFB的转化过程，对纤维化具有治疗作用。
结论：
1.TGF-β1可诱导MRC-5细胞产生氧化损伤，导致其纤维化产生。
2.给予最大无毒浓度的贝母组分均可使TGF-β1诱导的MRC-5细胞内降低纤维化因子的表达，说明安全浓度下的贝母组分可对氧化损伤的MRC-5细胞起到保护作用，减少纤维化损害。
3.贝母乙素可通过上调SOD、GSH的表达而发挥抗氧化、减少纤维化因子的产生的作用，其机制可能与Notch1/Jag1/Hes1信号通路有关。
4.贝母乙素可以通过抑制Notch信号通路，降低通路下游产物表达，进而起到保护细胞，减少氧化损伤，减缓FB向MFB的转化过程，对纤维化具有治疗作用。