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苹果果实的着色程度既是吸引人的典型特征之一,也是果实品质与成熟度的标志,并在一定程度上影响消费者的购买行为和商品价值。因此,寻求绿色安全的可促进苹果果实着色的有效措施,对于改善果品品质并提高其商品价值和市场竞争力具有一定意义。目前,已在多种果树中证实,利用生物体内卟啉化合物生物合成的关键前体5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic aicd,5-ALA)可明显改善果实着色与果品品质。但在套袋果园中,利用5-ALA直接喷布果实表面需去掉果袋,费工耗时;尤其是在套塑膜袋果园中,果实采收前并不去除果袋,无法将5-ALA直接喷施于果实表面。因而,探究便捷高效的5-ALA施用方式有利于拓展其在果树生产中的应用前景。此外,5-ALA调节植物类黄酮物质生物合成与转运途径尚不清楚。因而,需进一步研究5-ALA调控花青苷合成积累的分子机理,探明其调控过程中关键分子。本研究首先探究了在套塑膜袋的苹果园中利用根施5-ALA的方式对苹果着色状态及果实品质的影响;其次,基于苹果果实愈伤组织培养体系,利用高通量测序技术分析5-ALA诱导苹果果实愈伤组织着色的基因表达转录调节网络;然后,利用基因工程手段探究了 MdMYB9、MdMYBCl和MdMYBR16等3个R2R3类MYB转录因子在5-ALA调控苹果花青苷积累中的作用;最后,根据测序结果中5-ALA与油菜素内酯信号转导关系,探究了BR在5-ALA调控花青苷积累中的作用。主要研究结果如下。1.根施5-ALA后使苹果叶片及果实中内源5-ALA含量显著上升,表明5-ALA可由植物根系转移至植物地上部分。利用M-PEA检测植物光合荧光发现,根施5-ALA后显著提高了苹果叶片PS Ⅱ和PS Ⅰ光合性能,表明5-ALA处理苹果树后能够使得果实积累更多的同化物以提高果实品质。同时,根施5-ALA能够显著增加果实重量和总黄酮含量、可溶性固形物含量、抗坏血酸含量以及抗氧化酶活性,尤其是提高果实着色程度。这些结果表明通过根施而并非直接喷布果面,5-ALA依然能够有效提高果实内在和外在品质。此外,利用以‘富士’苹果果实为外植体而诱导的愈伤组织,研究发现5-ALA能够上调诸多参与类黄酮代谢基因的表达水平。2.将‘富士’苹果果实愈伤组织培养体系与Illumina RNA测序技术结合,分析5-ALA调节果实着色过程。愈伤组织在5-ALA溶液中振荡处理3 h后,分别光照处理24 h、48 h和72 h,鉴定到1232、1107和418个差异表达基因(DEG)。GO分析表明,1941个DEG被归类到了 85个门类中,主要涉及到生物过程及分子功能。KEGG通路与富集分析表明,三个处理时间点的DEG均能富集到类黄酮生物合成途径(ko00941)。5-ALA诱导的愈伤组织中,花青苷生物合成的结构基因MdCHS、MdCHI、MdF3’H、MdDFR、MdLDOX/ANS和MdUFGT,以及黄酮醇生物合成的关键基因MdFLS和MdLAR表达均显著上调。同时,花青苷从胞质运往液泡中的关键基因MdGST和MZMATE表达水平也显著上调,暗示着花青苷转运受到5-ALA处理的促进。此外,在三个时间点中还鉴定到了诸多转录因子(Transcript factors,TFs),如MYB、AP2/EREBP、bHLH、C2H2、NAC和WRKY的表达受到促进,7种植物激素信号转导过程也受到外源5-ALA调节。这些结果表明,多种调节分子和信号转导途径参与到5-ALA诱导花青苷积累过程。3.在诸多转录因子中,我们鉴定到3个位于不同染色体的R2R3类的MYB转录因子,MdMYB9、MdMYBC1及MdMYBR16。基因表达分析显示,它们能够迅速响应5-ALA诱导,并与花青苷合成及转运基因的表达呈现显著正相关关系。利用基因工程手段,分别构建MdMYB9、MdMYBC1及MdMYBR16过表达与干扰载体,转化苹果果实愈伤组织后发现,MdMYB9、MdMYBC1及MdMYBR16过表达愈伤组织中花青苷含量显著高于空质粒对照,外源5-ALA处理可进一步提高MdMYB9、MdMYBC1及MdMYBR16过表达愈伤组织中花青苷含量。而在基因干扰型愈伤组织中,5-ALA诱导愈伤组织花青苷积累效应明显被削弱。基因表达分析显示,在3个TFs过表达愈伤组织中,5-ALA调控花青苷代谢结构基因表达效应进一步提高,但在干扰型愈伤组织中却是明显受抑。这些结果表明,MdMYB9、MdMYBC1及MdMYBR16参与调节5-ALA诱导花青苷积累过程。4.基于高通量测序结果中发现的5-ALA与油菜素内酯信号转导关系,我们以苹果果实愈伤组织为材料,发现5-ALA和24-表油菜素内酯(24-EBL)单独使用或者两者共同使用均可促进花青苷积累,特别是两者共同使用时表现出更为有效的促进效应。同时,5-ALA、24-EBL和5-ALA+24-EBL还能够诱导总黄酮积累。分析花青苷和黄酮醇组分后发现,5-ALA、24-EBL和5-ALA+24-EBL处理后的愈伤组织中矢车菊素-3-半乳糖苷、槲皮素半乳糖苷、槲皮素和山奈酚含量成倍增加。然而,油菜素内酯生物合成抑制剂芸苔素唑(Brz)能够显著抑制5-ALA诱导的类黄酮物质积累,表明5-ALA诱导的类黄酮物质积累可能依赖油菜素内酯生物合成。qRT-PCR结果显示,5-ALA及5-ALA+24-EBL处理后能够上调调节基因,包括MdMYB10、MdMYB9、MdbHLH3及MdbHLH33的表达,同时上调花青苷合成及转运基因表达,包括MdCHS、MdF3’H、MdDFR、MdANS、MdUFGT、MdGST和MdMATE,甚 至还明显上调黄酮醇合成基因MdFLS表达。同时,5-ALA还能够诱导参与油菜素内酯信号转导的MdBRI1、MdBAK1和MdBZR1表达上调。此外,24-EBL能够提高5-ALA对类黄酮物质生物合成及油菜素内酯信号转导基因表达的诱导作用,但Brz表现出相反的效应。因此,我们认为24-EBL参与5-ALA诱导的花青苷及黄酮醇积累。以上结果为探究5-ALA调控花青苷合成与转运的分子机制开拓了新视野,同时也为黄酮醇代谢研究提供了新思路。