研究背景及目的血管生成（angiogenesis）是指由多种因子共同参与，在原有血管网的基础上通过内皮细胞芽生出新生血管的复杂过程，在肿瘤的生长、侵润和转移过程中发挥重要作用。其中，整合素在肿瘤组织新生血管内皮细胞的表达与肿瘤血管生成密切相关。整合素是细胞黏附分子家族的重要成员之一，是由一条α链和一条β链以非共价键链接而成的异二聚体，以跨膜蛋白形式广泛分布于细胞表面，主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间（extracellular matrix, ECM）的黏附。迄今已发现18种α亚单位和8种β亚单位，以及由不同亚单位组成的20余种整合素，其中整合素α_vβ₃（α_vβ₃受体）在介导血管内皮细胞与肿瘤细胞的黏附、参与肿瘤血管生成、促进肿瘤生长和转移等方面发挥重要作用。α_vβ₃受体的表达具有一定特异性，它在成熟血管内皮细胞中很少表达，但在肿瘤组织新生血管内皮细胞和部分肿瘤细胞表面呈高水平表达，使其成为抑制肿瘤血管生成研究的新靶点。研究发现，含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）序列的小分子多肽是一类高效α_vβ₃受体拮抗剂，能够选择性抑制培养肿瘤细胞的增值和肿瘤组织的生长，其中含两个二硫键的RGD多肽对肿瘤血管生成的抑制率最高。目前，用于治疗恶性肿瘤的整合素抑制剂中，部分含RGD序列的小分子多肽已进入Ⅲ期临床实验。利用放射性核素标记含RGD序列的小分子多肽来实现α_vβ₃受体显像及核素靶向治疗已成为肿瘤分子核医学的研究热点之一。本研究通过多肽化学合成技术对自行设计的环形RGD九肽（RGD-4CK）进行甘氨酸-丙氨酸（D）-甘氨酸-甘氨酸-γ氨基丁酸［GA（D）GG-Aba］修饰，探讨⁹⁹Tc^m标记GA（D）GG-Aba-RGD-4CK（TP1326）的最佳条件、标记物的理化与生物学性质、正常动物体内示踪动力学及组织动态分布特点、荷瘤裸鼠体内肿瘤显像与竞争结合显像，为以整合素α_vβ₃为靶点的受体显像研究奠定基础。研究方法1．⁹⁹Tc^m-TP1326的制备：化学合成制备TP1326，并以氯化亚锡为还原剂进行⁹⁹Tc^m标记，纸层析法测定标记率并计算比活度。2．⁹⁹Tc^m-TP1326的理化与生物学性质鉴定：通过体外稳定性实验、HPLC分析、血清蛋白结合实验和油/水分配实验，鉴定标记物的理化与生物学性质。3．健康大耳兔体内示踪动力学实验：取9只健康雄性大耳兔，经耳缘静脉注射200μl（37MBq）⁹⁹Tc^m-TP1326溶液，分别于1.5、3、5、10、30、60、120、240、480min从对侧耳缘静脉采血、称重，γ计数仪测量放射性计数（cpm），经测量效率校正后计算血液放射性浓度（kBq/L）。通过药代动力学分析软件DAS3.1.0对房室模型进行综合分析、判断，得出最佳房室模型、拟合曲线及示踪动力学参数。4．健康大耳兔SPECT显像研究：将健康雄性大耳兔仰卧位固定于实验台上，探头视野中心对准兔胸腹部。经耳缘静脉注射200μl（74MBq）⁹⁹Tc^m-TP1326溶液，立即以1帧/s采集1min，1帧/min采集59min，并于1.5、2、2.5、3、4h分别预置计时1.06min、1.12min、1.19min、1.26min、1.42min采集1帧图像，定性观察各主要组织器官的放射性动态分布变化。5．健康小鼠体内分布实验：将7.4MBq标记物定容至500ml，混匀后向5支放免试管中分别加入1ml溶液，测量其放射性（cpm），将放射性计数平均数乘以500，即为参考源的放射性计数。按随机数字表法将35只健康昆明小鼠分为7组，每组5只。经尾静脉注射标记溶液200μl（7.4MBq），分别于1、5、10、30、60、120、240min处死，收集血液、心、肺、肝、肾、肠、肌肉、骨、脑，分别称重并测量其放射性，经参考源校正后计算每克组织百分注射剂量率（%ID/g）。绘制体内放射性分布图。6．荷瘤裸鼠显像研究：将荷人黑色素瘤B16裸鼠仰卧位固定，经尾静脉注射标记溶液100μl（7.4MBq）。分别于30、60、90、120、180及240min经时间衰减校正后各预置计时采集1帧，观察荷瘤裸鼠体内肿瘤组织及其他组织器官放射性的动态分布变化，利用ROI技术测定肿瘤与对侧软组织的T/NT放射性比值。7．荷瘤裸鼠竞争结合显像研究：基本实验方法同上，不同的是先经荷瘤裸鼠尾静脉注射300倍非标记TP1326（100μg），1h后注射标记多肽，观察TP1326对肿瘤组织摄取⁹⁹Tc^m-TP1326的影响，评价标记多肽与肿瘤组织结合的特异性。结果1．⁹⁹Tc^m-TP1326的制备：化学合成TP1326的纯度为97.31%，⁹⁹Tc^m-TP1326的标记率为（95.86±0.83）%，直接法计算其比活度为（38.62±0.32）TBq/mmol。2．理化与生物学性质鉴定：标记多肽室温放置4h后，其放射化学纯度（radiochemical purity, RCP）为（91.76±2.75）%； TP1326的HPLC保留时间与⁹⁹Tc^m-TP1326的洗脱液放射峰值时间基本一致（约14min）；Sephadex G50柱层析未见明显蛋白结合放射峰；油/水分配系数为―（1.76±0.06）。3．健康大耳兔体内的示踪动力学实验：⁹⁹Tc^m-TP1326在健康兔体内动力学符合权重为1/c的二室模型，t1/2α、t1/2β分别为（3.115±0.771）min、（76.978±22.460）min，清除率（CL）为（4.508±3.316）ml/min。4．健康大耳兔SPECT显像研究：血池影消退迅速，放射性主要经肾脏清除，肠道、胃区、颈部未见明显放射性浓聚，脑呈低放射性本底影。5．健康小鼠体内分布实验：注射后初期，标记多肽放射性主要分布于血液、心脏和肝脏，并随时间迅速下降；肾脏放射性呈持续高水平；肠道放射性并未随肝脏放射性降低而升高；肌肉、脑组织呈持续低放射性分布。6．荷瘤裸鼠显像研究：30min肿瘤清晰显影，1h时肿瘤与肌肉的T/NT比值最高，约5.26。7．荷瘤裸鼠竞争结合显像研究：注射显像剂后1h，肿瘤影像明显减淡，T/NT比值约2.83，抑制率约46.2%。结论1．本研究成功制备了标记率高（＞95%）、稳定性好的⁹⁹Tc^m-TP1326，标记方法简便，常温下即可完成，无需分离纯化可直接应用，易于制备成一步法标记冻干试剂盒。2．⁹⁹Tc^m-TP1326血液清除迅速，主要通过泌尿系统排泄，具有优良的体内动力学特性。3．荷人黑色素瘤B16裸鼠肿瘤组织特异性浓聚⁹⁹Tc^m-TP1326，肿瘤影像清晰，T/NT比值高。是一具有潜在应用价值的肿瘤α_vβ₃受体分子显像剂。