论文部分内容阅读
乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenases,ADH,EC 1.1.1.1）因在疾病诊断及医学分析、食品科学、生物技术与酶工业等领域具有普遍的应用而受到广泛关注。人ADH是以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）为辅酶、以锌原子为辅基的二聚体酶,能可逆地催化醇和醛类的氧化反应,是乙醇代谢的关键酶。人体内,高浓度乙醇的初级代谢主要发生在胃,其中胃乙醇脱氢酶δδ-ADH在乙醇的初级代谢中发挥主要作用,然而由于δδ-ADH在酸性条件下酶活低的特点,限制了其应用范围。本文对人源δδ-ADH的编码基因adh7进行了克隆表达、酶学性质以及固定化改性的初步研究,获得具有乙醇耐受性及酸稳定性的固定化乙醇脱氢酶。根据人源δδ-ADH的编码基因序列化学合成目的基因adh7,构建重组表达载体pET-32a（+）-adh7,并转化E.coli BL21（DE3）构建工程菌E-ADH,目的蛋白以无活性的包涵体形式大量表达,SDS-PAGE结果显示重组蛋白分子量为59 kDa。以包涵体溶解液上清中的酶活为指标,对包涵体的溶解条件进行研究,通过正交优化实验确定最适的包涵体溶解液组成为1 mol?L-1尿素、溶解液pH为8.0、包涵体与溶解液的质量体积比为160 mg?mL-1（w/v）,最终获得包涵体溶解液酶活为0.391 U?mL-1,分离纯化其中的重组δδ-ADH并进行Tyr荧光光谱实验,结果表明包涵体溶解液中的重组δδ-ADH具有部分天然构象。用1mL HisTrapTM excel亲和色谱柱对复性后的溶解液进行分离纯化,纯酶的酶活为20.47 U?mg-1。对重组δδ-ADH的酶学性质进行研究,结果显示,重组蛋白的Km为16.9 mmol?L-1,kcat/Km为77.5 L·mmol-1?min-1。最适反应温度为40℃,40℃温浴90 min后相对酶活为61.6%;最适反应pH为9.0,在pH 3.011.0缓冲液中温浴30 min后,碱性条件下（pH7.011.0）酶活较稳定,在pH 3.0、pH 4.0中的酶液无活性。在1000 mmol?L-1乙醇溶液中40℃温浴40 min,相对酶活54.4%。针对重组δδ-ADH在酸性条件下酶活低的缺点,从带有正电荷基团的天然壳聚糖及市售五种阴离子交换树脂材料（D301、D318、D202、201×4、201×7）中确定了最适的固定化材料为壳聚糖。壳聚糖固定重组δδ-ADH的条件为:加酶量1.5 mL?g-1载体(粗酶浓度为0.3 mg?mL-1)、粗酶液pH为8.0、吸附温度40℃、戊二醛浓度2%、交联时间4 h。以50 mg?mL-1的壳寡糖对固定化酶进行后修饰并对其进行酶学性质研究。固定化后修饰酶的Km为21.9 mmol?L-1,最适反应pH为8.0,固定化后修饰酶在pH 3.0、pH 4.0下的酶活为0.094±0.021 U?g-1载体、0.138±0.002 U?g-1载体;固定化后修饰酶在1000mmol?L-1乙醇溶液中40℃温浴40 min,酶活是初始酶活的78.6%,说明固定化后修饰提高了其乙醇耐受性及酸性条件下的稳定性。