运动发酵单胞菌MMEJ特性鉴定及其在基因组编辑中的应用

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运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)具有独特的ED代谢途径和突出的乙醇生产能力,因此是研究纤维素类生物质生物炼制的主要底盘细胞。运动发酵单胞菌可以高效利用体内的微同源臂介导的末端连接(MMEJ)途径修复CRISPR-Cas系统造成的基因组DNA断裂。目前原核生物MMEJ的具体作用机制和规律还不清楚,使其应用受到限制。本研究首先揭示了运动发酵单胞菌MMEJ途径的修复特征,包括:微同源臂的长度多为6bp和12bp,微同源臂序列偏好于5’-(+1)GNANAA(+6)-3’,MMEJ介导的DNA缺失片段的长度多为40-70 bp和300-500 bp,缺失片段位置偏向于靶标位置的5’端等。本研究在CRISPR-Cas系统和MMEJ途径的基础上开发了一种高效快捷的基因组编辑工具。该MMEJ基因编辑工具只需要构建一个带有mini-CRISPR(Repeat-Spacer-Repeat)的自靶向质粒,其中其间隔序列(spacer)与靶标DNA(protospacer)匹配。自靶向质粒介导内源CRISPR-Cas系统切割靶标DNA,随后触发MMEJ途径修复断裂的DNA,从而造成靶标DNA上可预测大小的DNA片段缺失。本研究利用上述MMEJ基因编辑工具成功编辑了 8个基因,并鉴定了 σ28编码基因的功能。本研究进一步通过转化带有两个间隔序列(spacer)的自靶向质粒,利用MMEJ基因编辑工具成功敲除了 15.7 kb的大片段基因组DNA。此外,本研究优化了该工具,通过选择GC含量更低的靶标位置和改造自靶向质粒,显著提高了 MMEJ效率。综上所述,本研究揭示了 MMEJ修复途径的规律,并基于内源性CRISPR-Cas系统和MMEJ修复系统构建了一种用于运动发酵单胞菌的基因编辑工具,可高效快捷地完成单基因编辑、基因功能鉴定、大片段敲除等工作,有助于全面解析运动发酵单胞菌的生物元件,为改造优化运动发酵单胞菌提供坚实的基础。
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