研究背景和目的原发性肺癌是目前对人类危害最大的恶性肿瘤之一,由于其高发病率及高恶性程度,每年致死人数占世界范围内肿瘤死亡人数的第一位。在所有原发性肺癌中,主要的类型是非小细胞型肺癌(NSCLC),包括鳞癌、腺癌、大细胞肺癌等,约占所有肺癌总发病率的85%以上。目前对非小细胞肺癌的治疗方法多采用手术切除、放射学治疗和化学治疗等综合性治疗手段,但是患者的预后仍不乐观,据统计Ⅲ-Ⅳ期晚期NSCLC患者的5年生存率仅有不到15%。同其他恶性肿瘤类似,NSCLC患者尤其是晚期患者其预后不良的最主要原因主要是肿瘤细胞难以做、到完全清除,而恶性肿瘤细胞所具有的高增殖能力和高远处转移特点往往造成肿瘤局部未控导致残存细胞的复发以及远处转移。因此,寻找新型治疗手段就成为了当前病理学家和临床医师的研究重点。近几年来,针对恶性肿瘤基因突变的基因治疗和发生发展机制的分子治疗已取得了一定的疗效,例如针对BRAF V600E基因变异的黑色素瘤的darafenib和trametinib有效改善了患者的生存质量和预后；而血管生成因子(VEGF)抑制剂阿伐斯汀(Bevacizumab)目前也应用于多种恶性肿瘤的辅助治疗,并取得了较为令人满意的疗效。然而,由于恶性肿瘤基因变异的异质性和多样性,以及异常复杂的分子机制,当前的基因和分子治疗手段仍无法完全根治恶性肿瘤。因此,仍需要我们进一步对恶性肿瘤的机制进行研究。miRNA是一种长约16-25碱基长度的单链小分子RNA,尽管分子量小,在基因组中所占的比例小,但在细胞中却发挥着异常强大的调节作用。miRNA在细胞核内被转录后,继而进行初步的剪切修饰,并转运至细胞质内进行最终修饰,并形成成熟的可发挥基因转录调节作用的miRNA。miRNA通过自身的特异性结合位点,对靶基因转录形成的mRNA上3’UTR和5’UTR上特定的识别区域进行识别和连接,进而与一系列功能性蛋白质结合形成沉默复合体,继而引起所识别的mRNA的降解,从而在转录后水平上阻断靶基因的翻译和蛋白质的表达。当前的研究主要集中于靶基因mRNA的3’UTR端miRNA:mRNA的相互作用。由于每个mRNA都可以识别多达20余个靶基因转录的mRNA,因此尽管miRNA的转录基因在基因组中所占比例很小,仅占所有转录基因的1-5%,却可以调节多达30%的功能性基因的表达。根据靶基因的不同,miRNA可以参与调节包括细胞周期、细胞发育分化以及细胞凋亡等众多功能。除了以上正常的生理性功能的调节作用之外,近年来越来越多的研究发现miRNA在肿瘤的发生发展过程中也起着至关重要的作用。由于miRNA在肿瘤中起到抑癌因子或者癌基因的效果,因此针对其功能进行相应的miRNA治疗就成为了近来肿瘤领域研究的热点。例如,Zhao等人发现,miR-497在肾癌中的表达显著降低,并且与肿瘤的临床分期、组织学分级以及淋巴结转移密切相关。Sun等人发现,miR-646在骨肉瘤中的表达明显降低,同时在骨肉瘤细胞系中miR-646可以通过抑制靶基因FGF2的表达有效抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。Yang等人报道称,在人类胶质瘤中miR-221/222的表达显著上调,并通过调节TIMP2提高了胶质瘤细胞系的侵袭和血管生成能力。Zou等人在脊索瘤中发现,miR-140-3p存在过表达,同时高表达miR-140-3p的患者与不良预后密切相关。然而,目前关于miR-140-3p在NSCLC中研究仍未发现任何报道。ATP8A1是一种氨基磷脂酰基转移酶(APLT),主要功能是将磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)转运通过脂双层膜。Kato在最近发表的文章中称,ATP8A1和CDC50A可以组成复合物,并进而促进细胞的迁移能力。同时ATP8A1的表达降低可以导致磷脂酰乙醇胺暴露于细胞表面。而磷脂酰乙醇胺的外露导致的膜脂质双层失对称性是细胞凋亡的标志之一。本研究针对miR-140-3p和ATP8A1在NSCLC中的病理性作用及可能的治疗潜力进行了两大部分研究。在第一部分中,我们首先通过生物信息检索软件TargetScan等确认了miR-140-3p的靶基因ATP8A1,并利用免疫组织化学、qRT-PCR、Northern blot、western blot和荧光素酶检测针对这两个目的基因在NSCLC中的表达以及相互之间是否存在miRNA::mRNA相互识别进行了验证和研究。同时针对ATP8A1与NSCLC患者的临床病理指标间可能存在的相关关系进行了研究。在第二部分,我们利用miR-140-3p的过表达对NSCLC细胞系进行了干预,在体外实验即细胞水平上对miR-140-3p治疗对NSCLC细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡能力的影响进行了验证,同时利用ATP8A1高表达载体验证了ATP8A1对miR-140-3p治疗效果的影响,并利用裸鼠NSCLC模型进行动物实验对miR-140-3p对裸鼠生长的影响进行了验证。第一部分miR-140-3p在非小细胞型肺癌中的表达及ATP8A1作为靶基因的临床病理研究方法1.我们收集了75例NSCLC标本,其中20例样本包括配对的NSCLC组织标本和相邻的正常肺组织样本(距癌灶边缘>5cm)。我们对75例NSCLC和20例正常肺组织样本制成的石蜡切片进行了免疫组织化学染色检测ATP8A1蛋白质的表达,并对ATP8A1蛋白免疫组织化学检测结果与NSCLC患者的临床指标间进行了相关性分析。2.我们对20对配对的NSCLC组织标本和正常肺组织样本进行了总RNA和总蛋白质提取,然后对ATP8A1的mRNA和蛋白质以及miR-140-3p的表达利用qRT-PCR、northern blot和western blot进行了进一步的研究。3.运用miRNA数据库分析了16对不同组织来源的肿瘤与相应正常成熟组织中miR-140-3p的表达水平。4.利用荧光素酶检测对ATP8A1是否为miR-140-3p的靶基因进行了验证。结果1. ATP8A1蛋白质在NSCLC中的表达升高在经过免疫组织化学检测后,在20例正常肺组织中未发现ATP8A1蛋白质的表达,而在NSCLC中呈明显的过度表达 (P< 0.01)。 ATP8A1以细胞质着色为主,仅有散在的细胞核着色,其中强表达病例数高达61.3%(46/75)。qRT-PCR检测。结果显示,与正常肺组织相比,ATP8A1的mRNA表达水平在NSCLC中明显增高(P<0.01)。而Western blot检测ATP8A1蛋白质表达的结果与之类似,NSCLC中ATP8A1的蛋白质表达水平明显高于正常肺组织(P<0.01)。2. ATP8A1表达与非小细胞型肺癌患者的临床特征及病理组织分型之间的关系结果显示,ATP8A1的表达程度与细胞分化(P=0.009)、肿瘤体积(P<0.001)、是否淋巴结转移(P=0.001)和临床分级(P=0.003)密切相关。与之相反,ATP8A1基因与组织分型、性别和饮酒/吸烟史无关。同时,年龄对ATP8A1基因的表达也无影响。3. miR-140-3p在非小细胞型肺癌中的表达水平降低miRNA数据库结果显示,miR-140在绝大多数的肿瘤中的表达水平明显降低,其中包括肺癌组织,在正常肺组织中miR-140的表达水平较正常肺癌组织增加1.25倍。20对NSCLC患者与相应的肺癌组织的样本,并利用U6 RNA作为内参,运用qRT-PCR对miR-140-3p的表达情况进行了检测。结果显示,在20对肿瘤与正常组织中,miR-140-3p的表达在肿瘤组织中呈明显降低(如图1-2B所示)。而Northern blot结果与qRT-PCR结果相同(图1-2C)。4. 在 NSCLC中ATP8A1是miR-140-3p的靶基因与突变型载体Luc-ATP8A1-3’UTR-MUT相比,Luc-ATP8A1-3’UTR-WT转染细胞的荧光信号值在SPC-A1中降低了0.54倍,而在H1299中减低了0.61倍。但是与空白载体相比,转染Luc-ATP8A1-3’UTR-WT野生型的细胞中的荧光信号值没有发生变化。以上结果显示,miR-140-3p通过与野生型载体中的结合位点相结合,诱导了载体的降解并降低了荧光信号的释放。我们进一步通过western blot检测了miR-140-3p对ATP8A1蛋白表达的影响。与转染空白载体的NSCLC细胞相比,转染miR-140-3p mimics的细胞ATP8A1蛋白的表达明显降低。其中,SPC-A1降低了0.72倍,H1299降低了0.59倍。而qRT-PCR检测结果显示,miR-140-3p mimics使SPC-A1中的ATP8A1的mRNA表达量降低了0.67倍,在H1299中降低了0.59倍。因此,在NSCLC细胞中表达增加的miR-140-3p可以有效降低内生性ATP8A1的mRNA和蛋白质表达水平。结论1. ATP8A1在NSCLC组织中的蛋白质和mRNA表达水平明显高于在正常肺组织中的表达。同时ATP8A1的免疫组织化学检测与NSCLC的细胞分化水平、肿瘤体积、淋巴结转移和临床分期密切相关。ATP8A1可以作为NSCLC的有效诊断指标。2.miR-140-3p在NSCLC组织中的表达明显下调,提示miR-140-3p在NSCLC中可能作为抑癌因子存在。3. ATP8A1是miR-140-3p的靶基因。第二部分miR-140-3p抑制靶基因ATP8A1表达在非小细胞型肺癌的体外和体内研究方法1.在体外实验中,使用miR-140-3p mimics和对照组空白载体分别转染NSCLC细胞系SPC-A1和H1299,然后分别使用细胞集落形成实验和MTT实验检测miR-140-3p对NSCLC细胞系增殖能力的影响；利用细胞伤痕愈合实验和transwell侵袭实验检验miR-140-3p对NSCLC细胞系侵袭和迁移能力的影响；运用流式细胞检测技术检测miR-140-3p对NSCLC细胞系凋亡的影响。并利用ATP8A1过表达载体研究ATP8A1对miR-140-3p导致的增殖能力和侵袭迁移能力的变化的作用,以证实miR-140-3p所发挥的生物学调节作用是否通过ATP8A1来实现。2.在体内实验中,将转染miR-140-3p mimics和对照组空白载体的SPC-A1细胞系分别接种于4对裸鼠,建立裸小鼠NSCLC皮下种植瘤模型,每4天测量皮下种植瘤的体积,并在建模第25天处死小鼠,取瘤称重,并做进一步分析。结果1. miR-140-3p抑制NSCLC细胞系增殖和生长能力与转染空白对照mimics相比,转染miR-140-3p mimics后,SPC-A1的miR-140-3p的相对表达水平增加了8.2倍而H1299增加了7.8倍。与转染空白对照mimics相比,肿瘤细胞系SPC-A1和H1299在转染miR-140-3p mimics后的生长能力分别减低了0.6倍和0.7倍(MTT法)。与MTT法检测结果相似,集落形成实验检测NSCLC细胞系的增殖能力,SPC-A1降低了36%而H1299减低了51%。提示miR-140-3p可以长期影响NSCLC的增殖能力。另外,我们也在体内环境下利用裸小鼠模型检测了miR-140-3p对NSCLC肿瘤生长的作用。结果显示与对照mimics转染细胞的皮下种植瘤模型相比,miR-140-3p mimics转染的皮下种植瘤的生长明显受到了抑制(每组4只小鼠)。在注射肿瘤细胞25天后,转染miR-140-3p mimics的肿瘤平均重量为对照组肿瘤质量的38%。因此,miR-140-3p转染NSCLC细胞后可以在体内和体外实验中显著降低肿瘤细胞的生长和增殖能力。2. miR-140-3p抑制NSCLC细胞系的侵袭能力但增强凋亡为检测miR-140-3p是否会影响NSCLC细胞迁移和侵袭能力,我们进行了划痕愈合实验和小室侵袭实验。与对照组相比,SPC-A1转染miR-140-3p mimics后愈合率下降了0.37倍,而H1299则下降了0.34倍。侵袭实验结果类似：与对照组相比,SPC-A1转染miR-140-3p mimics后侵袭能力下降了0.64倍,而H1299转染miR-140-3p mimics后侵袭能力则下降了0.71倍。如前所述,细胞凋亡能力的改变是肿瘤发生和发展过程中的重要步骤,因此有必要检测miR-140-3p对NSCLC细胞系凋亡能力的影响。流式细胞检测结果显示与对照组相比,SPC-A1转染miR-140-3p mimics后凋亡能力增加了0.44倍,而H1299则增加了0.51倍。以上的结果显示,miR-140-3p在NSCLC细胞系中对肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力具有抑制作用,然而对程序性细胞死亡(凋亡)则具有促进作用。3. miR-140-3p对NSCLC肿瘤细胞增殖和侵袭的抑制作用可以被ATP8A1的高表达逆转为检测ATP8A1蛋白的表达增加是否可以逆转miR-140-3p的肿瘤抑制作用,我们分别使用ATP8A1过表达载体pCDNA3.0::ATP8A1转染了SPC-A1和H1299细胞系。与仅转染miR-140-3p mimics的对照组相比较,MiR-140-3p在转染pCDNA3.0::ATP8A1的表达分别在SPC-A1和H1299中降低了0.13倍和0.15倍；但是与转染空白载体的对照组相比,则分别增加了3.8倍和4.7倍。ATP8A1蛋白质表达在共转染miR-140-3p mimics和高表达ATP8A1载体的NSCLC中与转染对照组mimics的细胞系相比较无明显变化,但是与仅转染miR-140-3p mimics的细胞系比较则明显增高。与转染miR-140-3P的细胞系相比,转染ATP8A1高表达载体的SPC-A1和H1299细胞系的增殖能力分别增加了1.1倍和0.81倍。与之类似的是,与仅转染miR-140-3p mimics的NSCLC细胞系相比,共转染miR-140-3p和ATP8A1高表达载体pCDNA3.0::ATP8A1的SPC-A1和H1299细胞系的侵袭能力分别增加了1.71倍和1.91倍。以上结果显示,ATP8A1的表达增加可以部分抵消miR-140-3p对NSCLC细胞系增殖和侵袭能力的抑制。结论1. miR-140-3p可以通过抑制NSCLC的细胞生长、迁移和侵袭但同时增加细胞凋亡的方式发挥抑癌因子的作用。2.裸小鼠NSCLC皮下种植瘤的生长也受到了miR-140-3p的抑制作用。3.细胞内ATP8A1蛋白的表达水平增加可以部分抵消miR-140-3p对NSCLC细胞生长和迁移能力的抑制作用。ATP8A1可以促进NSCLC细胞的生长增殖和侵袭迁移能力。4. miR-140-3p对NSCLC细胞生长增殖和侵袭迁移能力的抑制是部分通过调节ATP8A1的表达实现的。