论文部分内容阅读
结肠直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，miRNA在该疾病的发生和发展中都具有作用。据报道，miRNA能够识别靶基因mRNA的3’UTR，抑制蛋白翻译，从而调节目的基因的表达及参与生物体生命活动中。在结肠直肠癌治疗中，药物的耐药性是阻碍治疗的重要影响因素，其中miRNA也参与到药物的敏感性机制中。本实验的研究目的即是检测miR-378在结肠直肠癌中的生物学功能。本实验主要从四部分验证miR-378在结肠直肠癌发生发展及治疗中的作用。一：检测miR-378在结肠直肠癌组织、细胞系、血清中的表达及临床意义，并检测miR-378在细胞系内的相关生物功能。二：通过生物信息学预测miR-378下游靶基因，并鉴定miR-378通过识别靶基因调节相关的生物学通路。三：我们还研究了miR-378在L-OHP诱导的结肠直肠癌凋亡中的作用。四：应用裸鼠移植瘤实验验证miR-378的生物学功能。方法：一：利用定量PCR的方法检测20对结肠直肠患者癌组织及癌旁组织miR-378的表达；检测6种癌细胞系HCT116、HT29、DLD-1、LOVO、SW620、SW480和两种正常结肠直肠上皮细胞系FHC、NCM460中miR-378的表达；检测51例患者血清内miR-378的表达，并分析其与结肠直肠癌患者生存曲线的关系。在结肠直肠癌细胞系HCT116及HT29中，转染miR-378mimics及mimicscontrol，提高细胞内miR-378的表达水平。在通过克隆形成、MTT活性检测、PI染色流式检测周期实验来检测细胞过表达miR-378后对增殖、生长曲线、细胞周期及凋亡的影响。二：通过生物学信息查找miR-378识别的靶基因。通过定量PCR及western blotting检测过表达miR-378后，CDC40mRNA及蛋白的表达。通过质粒构建方法将CDC40mRNA的3’UTR野生型及突变性序列构建到荧光报告基因载体上。在HCT116和HT29细胞内分别共转CDC3’UTR wt+mimicscontrol、CDC3’UTR wt+miR-378mimics、CDC3’UTR mut+mimics control，和CDC3’UTR mut+miR-378mimics,检测miR-378对于CDC403’UTR序列的识别作用。在结肠直肠癌细胞HCT116和HT29内转染si-control和CDC40siRNA-1/2,抑制CDC40的表达。在通过MTT活性检测、克隆形成、PI染色流式检测周期实验来检测细胞敲减CDC40后对增殖、生长曲线及细胞周期的影响。在细胞HCT116及HT29内分别转染mimics control，pCMV6vector+miR-378mimics、pCMV6/CDC40+miR-378mimics，用过表达PARK7的方法恢复miR-378所造成的CDC40的降低。在通过MTT活性检测、克隆形成及PI染色流式检测周期实验来检测细胞恢复CDC40表达后对增殖及细胞周期的影响。定量PCR及免疫组化检测20例结肠直肠癌组织及癌旁组织内miR-378的mRNA及蛋白的表达。三：在结肠直肠癌细胞HCT116及HT29中，分别过表达miR-378后，利用Annexin-V/7-AAD染色及细胞流式检测细胞凋亡比率。在HCT116及HT29内转染miRNAcontrol及miRNAmimics后，利用不同浓度的L-OHP处理，MTT检测细胞的活性。利用同一浓度的L-OHP处理转染后的HCT116及HT29，Annexin-V/7-AAD染色及细胞流式检测细胞凋亡变化。四：利用HCT116细胞，分别转染miR-control和miR-378mimics，过表达miR-378。等足够数量的细胞处于对数生长期，获取并融在适量的浓度。在裸鼠右肩部注射100uL，在第6天开始检测肿瘤长度和宽度，27天后剥瘤称量。结果：一:miR-378在人类结肠直肠癌中的表达及生物学意义在20对结肠直肠癌组织及癌旁组织中，90%的癌组织内miR-378表达呈显著降低（P＜0.01）。在6种结肠直肠癌细胞内，miR-378相比于正常结肠直肠上皮细胞也呈现低表达，并具有均差异显著性（P＜0.05）。在原发性及转移性患者血清中，miR-378表达水平分别为2.63±1.13、2.87±1.08，与正常志愿者血清中表达水平相比显著升高（P＞0.05）。Kaplan–Meier生存曲线结果显示miR-378表达与患者生存期无显著相关性（P>0.05）。克隆形成实验及细胞周期检测过表达miR-378抑制HCT116及HT29细胞的生长，抑制周期的进行（P＜0.05）。二：miR-378通过CDC40调节结肠直肠癌细胞的生长及周期在PicTar和TargetScan数据库中，miR-378均能够和CDC40mRNA的3’UTR互补配对。通过荧光素酶报告分析检测可知，miR-378能够识别CDC40mRNA的3’UTR，抑制荧光素酶的活性（P＜0.05）。在HCT116及HT29内，过表达miR-378能够抑制CDC40蛋白和mRNA的表达（P＜0.05）。CDC40siRNA-1/2降低了细胞内CDC40的mRNA和蛋白的表达（P＜0.05），克隆形成实验及流式检测细胞周期结果显示敲减CDC40后，抑制细胞克隆的形成及阻抑细胞周期的进行。在恢复实验中，通过转染过表达CDC40质粒过表达CDC40，恢复了过表达miR-378造成的CDC40的降低，并且克隆形成实验显示恢复了细胞克隆形成的能力。定量PCR检测20例结肠直肠癌患者癌组织内CDC40高表达，相较于癌旁组织。CDC40的表达与miR-378的表达呈反相关（R=-0.710,P=0.0005）。免疫组化检测结果显示，CDC40表达在癌组织中显著高于癌旁正常组织。三：过表达miR-378提高L-OHP诱导的凋亡在细胞HCT116及HT29内，过表达miR-378对细胞凋亡的无显著影响。利用不同浓度的L-OHP处理，过表达miR-378降低了L-OHP对细胞的半致死剂量（P＜0.05）。4μM L-OHP处理过表达miR-378的HCT116及HT29，结果显示过表达miR-378后显著提高L-OHP诱导的细胞凋亡（P＜0.05）。原位末端标记法同样显示过表达miR-378促进L-OHP诱导向细胞凋亡。四：体内动物实验验证miR-378对结肠直肠癌细胞生长的影响接种细胞后每隔2天检测一次肿瘤的长度和宽度，随着接种时间的增加，过表达miR-378的肿瘤生长的速度明显慢于对照组，差异具有显著性（P＜0.05）。在27天剥瘤后，过表达miR-544的肿瘤的重量显著少于对照组，差异具有显著性（P＜0.01）。结论：(1): miR-378在结肠直肠癌组织内及癌细胞系内均低表达，在结直肠患者血清高表达，血清miR-378表达水平与患者生存曲线无显著相关性。(2):体内及体外实验验证MiR-378能够抑制细胞增值。(3)：miR-378通过靶向结合CDC40调控细胞增殖。(4):过表达miR-378能够提高L-OHP诱导的细胞凋亡。