人血白蛋白(human serum albumin,HSA)是血浆中含量最高的一种蛋白成分,人血白蛋白制品是从人血浆中提取的一种治疗性药物。由于到血浆原料的限制,我国血浆来源的人血白蛋白(plasma derived human serum albumin,pHSA)不能满足国内的需求,而重组人血白蛋白(recombinant human serum albumin,rHSA)可以缓解人血白蛋白供应紧张的现状。基因重组药物中的宿主残留蛋白(host cell proteins,HCPs)容易引发严重的不良反应,宿主细胞引入的翻译后修饰(post-translational modification,PTM)容易造成蛋白药物结构的改变,引发安全问题。重组人血白蛋白的单次注射剂量超过10g,远超其他重组蛋白药物的注射剂量,如此高的注射剂量对产品的质量控制提出了更高的要求。本文就重组人血白蛋白宿主残留蛋白含量检测方法以及结构表征展开研究。本文的第一部分和第二部分为重组人血白蛋白宿主残留蛋白检测方法的研究,第三部分为重组人血白蛋白结构表征研究。第一部分。目的:为了比较通过模拟产品生产纯化工艺制备的ELISA试剂盒中的标准品抗原与真实生产过程中宿主细胞产生的宿主残留蛋白组成有无差异。方法:收集A厂家空载体发酵上清经第一步层析后制备的抗原和A厂家经过第一步层析的重组人血白蛋白过程中间品,使用nanoLC-MS/MS鉴定A厂家工艺特异性试剂盒中标准品蛋白种类,2DLC-MS/MS鉴定A厂家重组人血白蛋白过程中间品中的宿主残留蛋白种类。结果:在A厂家工艺特异性试剂盒标准品中,鉴定到97种蛋白,在A厂家重组人血白蛋白过程中间品中鉴定到32种宿主残留蛋白,过程中间品鉴定到的32种宿主残留蛋白有8种蛋白在ELISA试剂盒的标准品中并不存在。结论:通过模拟产品生产纯化工艺制备的工艺特异性ELISA试剂盒中的标准品蛋白组成与真实生产过程中宿主细胞产生的的宿主残留蛋白组成存在较大差异。第二部分。目的:鉴定重组人血白蛋白原液中宿主残留蛋白的种类。方法:采用2DLC-MS/MS对三个厂家不同批次的巴斯德毕赤酵母来源的重组人血白蛋白原液进行宿主残留蛋白鉴定。结果:A厂家两个批次的样品分别鉴定到24、23种宿主残留蛋白,B厂家样品鉴定到18种宿主残留蛋白,C厂家样品鉴定到10种宿主残留蛋白。结论:比较不同样品中鉴定到的宿主残留蛋白,发现蛋白C4R8K6在所有的样品中均存在,我们可以将这个蛋白作为指示蛋白开发重组人血白蛋白宿主残留蛋白通用检测试剂盒。第三部分。目的:表征不同来源的人血白蛋白结构,了解不同来源的重组人血白蛋白因宿主细胞翻译后修饰造成的结构变化。方法:采用top-down的分析策略,使用LC-qTOF对A、B、D、E四个厂家的重组人血白蛋白样品进行完整分子量以及肽图水平分析。结果:在A、B两毕赤酵母来源的重组人血白蛋白中K46这条肽段有高程度的糖基化,糖基化程度A样品高于B样品,样品D的糖基化程度最低;A、B、D、E四样品在M329位都存在不同程度的氧化,氧化程度B样品远高于其他样品;B样品存在高度半胱氨酸化修饰,E样品也存在一定比例的半胱氨酸化修饰;E样品中存在糖化现象。四个样品中脱酰胺化和甲酰化水平均较低。结论:不同宿主细胞翻译后修饰会给人血白蛋白结构带来变化,我们应当注意这些结构变化造成的人血白蛋白免疫原性以及物理化学性质的改变。