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研究背景与目的:骨关节炎(osteoarthritis,OA)是最常见的关节疾病,由于我国人口老龄化的加剧,OA对社会、经济影响越来越大。目前认为,OA不仅仅是局限于关节软骨的疾病,而是一个多因素的疾病,影响整个关节。局部和全身因素错综复杂,共同影响着OA关节的临床和病理表现,最终导致关节破坏。OA的发病机制尚不完全清楚,虽然药物治疗可缓解症状,但目前尚无延缓或阻止OA进展的药物问世。OA发病机制与多种信号通路相关,其中包括转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)信号通路、NF-κB信号通路、Wnt/β连环素信号通路、MAPK信号通路等。潜在转化生长因子β结合蛋白1(latent transforming growth factor beta binding protein 1,LTBP-1)是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的重要组成部分,在多种组织和细胞中表达,参与对TGF-β的激活,并可能通过作用于蛋白酶和其他因子调节TGF-β信号通路的活化。而TGF-β信号通路及LTBP-1是否在OA滑膜细胞中发挥调控作用尚未见报道。本课题组前期通过对人正常及OA成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviosyte,FLS)进行基因芯片测定,发现LTBP-1在OA组FLS表达增高。滑膜炎症促进OA的进展,OA关节滑液、滑膜以及关节软骨中发现存在多种促炎因子,其中白细胞介素1β(interleukin 1 beta,IL-1β)是软骨细胞和滑膜细胞分解代谢过程的有效调节因子,也是最常用来建立炎症模型的刺激因子之一。本研究旨在探讨人正常及OA成纤维样滑膜细胞和滑膜组织LTBP-1的表达差异,进而探究LTBP-1在OA滑膜TGF-β信号通路的调控作用,并通过IL-1β刺激OA成纤维样滑膜细胞模拟体内OA滑膜炎症环境,探索LTBP-1及TGF-β信号通路与滑膜炎症过程的关系,为OA的预防和治疗提供可能的靶点。研究方法:1.取自临床因外伤行大腿截肢术和因膝关节OA行人工全膝关节置换术的患者膝关节滑膜组织,采用酶消化法,体外分离、培养人正常及OA成纤维样滑膜细胞;经过传代后达到细胞纯化,采用流式细胞术实验检测细胞表面标志物vimentin、CD68表达,进行细胞纯度鉴定;采用CCK-8细胞增殖实验对人正常及OA成纤维样滑膜细胞增殖活性进行检测。2.采用免疫组化染色、Western blot实验对人正常及OA滑膜组织LTBP-1的表达进行检测;采用RT-qPCR、细胞免疫荧光、Western blot实验对人正常及OA成纤维样滑膜细胞LTBP-1的表达进行检测。3.采用RT-qPCR、Western blot实验对人正常及OA成纤维样滑膜细胞TGF-β及其pSmad1/5/8、pSmad2信号通路活化情况以及OA相关效应分子MMP-13的表达进行检测。4.采用LTBP-1 siRNA转染构建LTBP-1下调模型,并用RT-qPCR、Western blot实验进行验证;采用RT-qPCR、Western blot实验检测LTBP-1下调后人OA成纤维样滑膜细胞TGF-β及其pSmad1/5/8、pSmad2信号通路活化情况以及OA相关效应分子MMP-13的表达;采用CCK-8细胞增殖实验检测LTBP-1下调后人OA成纤维样滑膜细胞增殖活性变化情况。5.用中等剂量IL-1β(10ng/ml)刺激人OA成纤维样滑膜细胞24h,模拟体内OA滑膜炎症环境;采用RT-qPCR、Western blot实验检测IL-1β处理后人OA成纤维样滑膜细胞LTBP-1、TGF-β1、pSmad1/5/8、pSmad2信号通路活化情况及OA相关效应分子MMP-13的表达;用CCK-8细胞增殖实验检测IL-1β处理后人OA成纤维样滑膜细胞增殖活性的变化。研究结果:1.通过对临床滑膜组织的实验室处理,获得了高纯度的人正常及OA成纤维样滑膜细胞,经流式细胞术实验测定,体外培养细胞中vimentin阳性率达到95%以上,符合下一步实验要求;CCK-8细胞增殖实验结果表明,人OA成纤维样滑膜细胞增殖活性明显高于正常对照组。2.免疫组化染色、Western blot实验结果显示,与人正常滑膜组织相比,人OA滑膜组织LTBP-1表达明显增高;RT-qPCR、细胞免疫荧光、Western blot实验结果显示,与正常对照组相比,人OA成纤维样滑膜细胞LTBP-1表达明显增高。3.RT-qPCR、Western blot实验结果显示,与正常对照组相比,人OA成纤维样滑膜细胞TGF-β1、TGF-β3、pSmad1/5/8及MMP-13表达上调,pSmad2表达下调。4.RT-qPCR、Western blot实验证实,LTBP-1 siRNA转染构建LTBP-1下调模型构建成功;RT-qPCR、Western blot实验结果显示,下调LTBP-1后,人OA成纤维样滑膜细胞TGF-β1、TGF-β3、pSmad1/5/8及MMP-13表达下调,pSmad2表达上调;CCK-8细胞增殖实验结果显示,抑制LTBP-1表达后,人OA成纤维样滑膜细胞增殖活性明显降低。5.RT-qPCR、Western blot实验结果显示,中等剂量的IL-1β刺激后,人OA成纤维样滑膜细胞LTBP-1、TGF-β1、pSmad1/5/8及MMP-13表达上调,pSmad2表达下调;CCK-8细胞增殖实验结果显示,IL-1β刺激后人OA成纤维样滑膜细胞增殖活性明显增高。研究结论:本研究表明,LTBP-1通过调控人OA成纤维样滑膜细胞TGF-β信号通路,促进MMP-13等OA相关效应分子的表达,进而参与OA滑膜炎症的进展,最终在OA进程中发挥促进作用。因此,LTBP-1有望成为OA潜在预防及治疗的作用靶点。