研究背景肺癌是世界上发病率以及死亡率最高的癌症。肺癌主要有非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）以及小细胞肺癌（Small cell lung cancer,SCLC）这两大类型,非小细胞肺癌约占肺癌总数的80%-85%,根据病理类型,NSCLC 又可分为肺腺癌（Lung adenocarcinoma,LUAD）、肺鳞癌（Lung squamous cell carcinoma,LUSC）及大细胞肺癌三个主要类型,其中LUAD和LUSC是NSCLC的两个最主要的亚型,在NSCLC中分别占比50-60%、30-35%,可见肺腺癌是肺癌中发病率最高的类型。尽管在肺癌早期筛查、微创治疗技术、化学药物治疗、分子靶向治疗和免疫检查点抑制剂等方案已取得诸多进展,肺腺癌的5年生存率仍很低。这种具有死亡率高以及生存率低的特点,可能与肺腺癌细胞具有持续增殖能力以及抗凋亡能力等有关,由此可见,探索肺腺癌增殖及抗凋亡的关键分子机制,寻找肺腺癌进展过程中的新的生物学标志物及关键治疗靶点,对肺腺癌防治极为重要,可有效改善患者预后。连接粘附分子（Junctional adhesion molecules,JAMs）是一个糖蛋白家族,属于免疫球蛋白超家族（Immunoglobulin superfamily,IgSF）的一员。JAM-A、JAM-B、JAM-C、JAM-4和JAML是JAMs的主要家庭成员。JAMs蛋白在细胞间连接组装、白细胞迁移和血小板活化等多种过程中均能发挥重要作用。近年来研究发现JAMs在肿瘤发生发展中也起到重要作用。JAM-A是其中研究最为广泛的蛋白。有多项研究表明,JAM-A表达增加通过激活与不依赖粘附的细胞内信号通路来驱动肿瘤发生并促进转移。同样,也有报道支持JAM-A的肿瘤抑制作用。JAM-A在不同的肿瘤当中发挥不同的功能,即使在同一类型肿瘤,如乳腺癌,JAM-A亦有促癌或抑癌作用的报道,因此尚无明确的JAM-A在癌症中的功能的共识,可见JAM-A的功能机制极为复杂。但关于JAML的研究尚不深入,尤其在JAML与肿瘤尤其是肺腺癌之间的关系,目前尚不十分清楚。2003 年新发现了一个 JAMs 家族成员,JAML（Junction adhesion molecule like protein,连接粘附分子样蛋白）,C末端缺乏传统的PDZ结合基序是JAML与家族中其他的JAMs蛋白之间的重要区别,该PDZ结合基序在靶向细胞间连接的过程中至关重要。与其他JAMs成员相比,JAML由于PDZ结合基序的缺失,在蛋白功能和靶向模式上JAML具有不同的可能性,即JAML可能拥有多样化表达,并可能在不同疾病中发挥功能。例如,在人的冠状动脉粥样硬化斑块中发现JAML高表达,载脂蛋白E（Apolipoprotein E,ApoE）小鼠模型的主动脉斑块中JAML也是高表达,对JAML进行阻断,发现可减轻ApoE小鼠动脉粥样硬化的程度并增强粥样硬化斑块的稳定性,提示JAML在动脉粥样硬化发生发展中起重要作用。在肠上皮急性炎症损伤时,在中性粒细胞募集失调的情况下,中性粒细胞可持续释放JAML,进一步破坏肠屏障,抑制肠粘膜愈合,针对此种情况,研究发现靶向JAML可达到改善粘膜愈合反应的作用。JAML在不同生理状态和多种病理生理过程中都发挥了及其重要的作用,但同时由于研究尚不深入,仍有很多功能尚未被人们所发现,亟需更深入的实验研究去进行探索。JAML与恶性肿瘤的关系引起了学者的广泛关注。最近一项研究发现人胃癌组织中JAML高表达并促进了胃癌的发展,部分原因是激活了 p38介导的信号通路。2022年有两篇关于JAML在肺腺癌中的作用的生物信息学分析发现从数据库中预测JAML在肺腺癌中低表达,但缺乏具体的实验数据支持。鉴于已有研究发现,JAMs尤其JAM-A在不同肿瘤中具有不同作用,可能为抑癌作用,也可能是促癌作用,而且JAML由于缺失PDZ结合基序,其蛋白功能及靶向模式的多样性更丰富,到底JAML在肺腺癌患者中表达水平如何,JAML对细胞增殖与迁移的影响,是否在肺腺癌的进展中发挥作用,具体可能涉及哪些信号通路,这些问题迄今尚未有研究解答。1 JAML在肺腺癌组织中的表达及临床意义目的:探讨JAML在肺腺癌组织中的表达水平;对不同表达水平JAML与肺腺癌患者的临床基线资料进行相关性分析。方法:1.收集肺腺癌患者新鲜切除的癌及癌旁的配对手术标本,分别提取mRNA和蛋白进行RT-qPCR和Western blotting实验,从mRNA和蛋白水平分析JAML在肺腺癌组织与癌旁组织的表达差异。2.收集肺腺癌患者癌及癌旁的配对病理组织切片,通过免疫组织化学染色检测JAML在肺腺癌组织及癌旁组织中的表达水平,同时对JAML在肺癌组织中的表达进行定位;并采集所收集病理组织切片的肺腺癌患者的相关临床信息,对不同表达水平JAML与肺腺癌患者的临床基线资料进行相关性分析。3.在四种肺腺癌细胞系中,应用细胞免疫荧光技术对JAML在肺腺癌细胞中的表达位置进行定位。结果:1.在32位肺腺癌患者的新鲜切除的配对手术标本中发现,与癌旁组织相比,JAML在癌组织中表达明显升高。2.在126位肺腺癌患者的癌与癌旁的配对组织切片中进行免疫组织化学染色亦证实,与癌旁组织相比,JAML在癌组织中表达明显升高,且JAML表达定位于胞浆;高表达的JAML与肺腺癌患者较差的pN分期及pTNM分期相关。3.细胞免疫荧光实验亦证实JAML在肺腺癌细胞中的表达位于胞浆。结论:JAML在肺腺癌组织表达较癌旁组织明显升高,且高表达的JAML与肺腺癌患者进展的临床特征相关;在肺腺癌组织和肺腺癌细胞系中JAML表达均定位于胞浆。2 JAML对四种肺腺癌细胞系增殖、迁移、侵袭、细胞周期及细胞凋亡的影响目的:体外细胞水平探索JAML对四种肺腺癌细胞系增殖、迁移、侵袭、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法:1.应用 Western blotting 方法检测 A549、H1299、PC9、H1975 四种肺腺癌细胞系中内源性JAML的表达水平。2.应用小干扰RNA瞬时转染A549和H1299细胞进行JAML敲减,应用质粒转染PC9和H1975细胞进行JAML过表达,进一步应用Western blotting方法验证JAML敲减或者过表达效率。3.应用慢病毒转染肺腺癌细胞,嘌呤霉素进行筛选,针对A549细胞构建JAML敲减及对照组慢病毒（A549-shJAML、A549-shNC）,针对PC9细胞构建JAML过表达及对照组慢病毒（PC9-JAML-OE、PC9-Vector）,进一步应用Western blotting方法验证JAML敲减或者过表达效率。4.在体外细胞水平,应用CCK8实验、EdU实验及克隆形成实验检测四种肺腺癌细胞中敲减或者过表达JAML后对细胞增殖的影响;应用细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测四种肺腺癌细胞中JAML敲减或者过表达后细胞迁移和侵袭能力的变化。5.应用流式细胞仪检测JAML敲减或过表达后四种肺腺癌细胞中细胞周期和细胞凋亡的变化。结果:1.在四种肺腺癌细胞系中,内源性JAML的表达水平存在差异,A549、H1299细胞中内源性JAML的表达相对较高,PC9、H1975细胞中内源性JAML的表达相对较低。2.CCK8实验、EdU实验证实在A549和H1299细胞中应用小干扰RNA敲减JAML可抑制细胞的增殖能力,在PC9和H1975细胞中应用质粒过表达JAML可促进细胞的增殖能力;分别应用转染慢病毒敲减JAML的A549细胞和过表达JAML的PC9细胞进行克隆形成实验亦能证实JAML敲减可抑制细胞的增殖能力,JAML过表达可促进细胞的增殖能力。3.细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验证实在A549和H1299细胞中应用小干扰RNA敲减JAML可抑制细胞的迁移、侵袭能力,在PC9和H1975细胞中应用质粒过表达JAML可促进细胞的迁移、侵袭能力。4.流式细胞仪检测证实在A549和H1299细胞中应用小干扰RNA敲减JAML可引起延长G0/G1期比例,同时减少S期+G2/M期细胞比例,并可增加细胞凋亡的比例;在PC9和H1975细胞中应用质粒过表达JAML可引起S期+G2/M期细胞比例增加,伴随G0/G1期细胞比例降低,并可减少细胞凋亡的比例。结论:JAML在肺腺癌细胞系中发挥促癌基因的作用。JAML敲减使肺腺癌细胞的增殖下降,降低迁移及侵袭功能,出现G0/G1期停滞,并增加细胞凋亡;升高JAML可提高细胞的增殖能力,增强迁移及侵袭功能,可使S期+G2/M期细胞增加,并抑制细胞凋亡。3 JAML促进肺腺癌进展的分子机制研究目的:探讨JAML在四种肺腺癌细胞系增殖、侵袭、转移、凋亡等生物学过程当中发挥作用的分子机制。方法:1.应用Western blotting方法检测在四种肺腺癌细胞中JAML敲减或过表达后MMPs、Cyclin D1、凋亡相关蛋白以及EMT表型相关蛋白、Wnt/β-canetin及PI3K/AKT/mTOR信号通路中关键蛋白的变化。2.分别选择Wnt/β-canetin通路激动剂或者PI3K激动剂处理JAML敲减的A549细胞,应用Western blotting方法检测MMP2、MMP9和EMT表型相关蛋白及相关通路蛋白的变化,应用EdU实验及Transwell迁移和侵袭实验进行rescue实验,探讨rescue前后细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化。结果:1.在A549和H1299细胞中敲减JAML可下调MMP-2、MMP-9的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达,同时可下调抑凋亡蛋白Bcl-2、Survivin的表达,另外还会引起与细胞周期密切相关的Cyclin D1表达下降;在PC9和H1975细胞中过表达JAML可上调MMP-2、MMP-9的表达,上调Bcl-2、Survivin的表达,下调Bax的表达,另外还引起Cyclin Dl表达增加。2.在A549和H1299细胞中下调JAML后可减少EMT表型,并下调Wnt/β-catenin 通路中 β-catenin 及下游的 Cyclin D1 和 Survivin 的表达;在PC9和H1975细胞中转染JAML质粒后可增加EMT表型,并上调Wnt/β-catenin通路中β-catenin及下游的Cyclin D1和Survivin的表达。3.在A549及H1299细胞中,敲减JAML可下调PI3K的表达,同时下调p-AKT、p-mTOR的表达,而总AKT及总mTOR表达基本不受影响;在PC9和H1975细胞中,过表达JAML可上调PI3K的表达,同时上调p-AKT、p-mTOR的表达,而总AKT及总mTOR的表达基本不受影响。4.Wnt/β-catenin 激动剂 CHIR99021 处理（5 μ mol/ml,24h）JAML 敲减的 A549 细胞,Western blotting 证实 CHIR99021 可激活 Wnt/β-catenin 信号传导通路,并可部分回复JAML敲减引起的EMT表型的改变,同时可部分回复JAML敲减引起的MMP2、MMP9的降低。EdU实验及Transwell迁移及侵袭实验发现,CHIR99021可部分回复JAML敲减引起的A549细胞增殖及迁移、侵袭的降低。5.PI3K 激动剂 740Y-P 处理（10 μ g/ml,24h）JAML 敲减的 A549 细胞,Western blotting证实740Y-P可激活PI3K/AKT/mTOR信号传导通路,并可部分回复JAML敲减引起的MMP2、MMP9的降低。EdU实验及Transwell迁移及侵袭实验发现,740Y-P可部分回复JAML敲减引起的A549细胞增殖及迁移、侵袭的降低。结论:JAML敲减可下调增殖及抑凋亡蛋白的表达,抑制EMT,上调促凋亡蛋白,并使Wnt/β-catenin和PI3K/AKT/mTOR通路部分失活;JAML过表达可上调增殖及抑凋亡蛋白的表达,促进EMT,下调促凋亡蛋白,并使Wnt/β-catenin 和 PI3K/AKT/mTOR 通路过度活化。针对 Wnt/β-catenin 和PI3K/AKT/mTOR通路分别进行通路回复实验,证实Wnt/β-catenin通路部分参与JAML对肺腺癌细胞系的增殖、迁移、侵袭及EMT表型的影响,PI3K/AKT/mTOR通路部分参与JAML对肺腺癌细胞系的增殖、迁移、侵袭的影响。4 JAML对肺腺癌裸鼠移植瘤生长的影响及潜在机制目的:体内实验探索JAML对肺腺癌细胞增殖能力以及Wnt/β-catenin通路和PI3K/AKT/mTOR通路关键蛋白的影响。方法:1.将 24 只 BALB/c 裸鼠随机分为四组,A549-shJAML、A549-shNC、PC9-JAML-OE、PC9-Vector细胞分别皮下注射以构建裸鼠皮下成瘤模型。2.每周两次使用游标卡尺对测量皮下瘤,分别记录长径和短径。3.第28天时处死裸鼠,剥离出瘤组织,并测量瘤体的长径和短径,计算瘤体的体积。4.将皮下瘤组织取出后进行石蜡包埋,后续制备切片进行HE染色以及免疫组化染色评估JAML、Ki-67的表达以及Wnt/β-catenin通路和PI3K/AKT/mTOR通路中关键蛋白的表达。结果:1.JAML表达下调后裸鼠移植瘤成瘤时间延迟,生长缓慢,肿瘤的体积低于阴性对照组,提示JAML敲低抑制了 A549细胞在裸鼠体内的成瘤能力;JAML过表达后可减少裸鼠移植瘤成瘤时间,较阴性对照组,肿瘤的体积增加,提示高表达JAML增强了 PC9细胞的增殖能力。2.进一步应用免疫组织化学染色方法发现,相对于阴性对照,JAML降低后明显下调Ki67表达阳性率,意味着JAML敲低后肺腺癌细胞的增殖能力减弱;相对于阴性对照,JAML过表达后裸鼠肿瘤组织JAML表达升高,同时Ki67阳性率增加,提示JAML过表达的肺腺癌细胞的增殖能力增强;相对于阴性对照,JAML敲低后裸鼠肿瘤组织β-catenin、Cyclin D1、Survivin表达下降,同时PI3K、p-AKT、p-mTOR表达下降,提示JAML敲低的肺腺癌细胞的Wnt/β-catenin通路和PI3K/AKT/mTOR通路活性受到抑制;相对于阴性对照,JAML过表达后裸鼠肿瘤组织β-catenin、Cyclin D1、Survivin表达升高,同时PI3K、p-AKT、p-mTOR表达升高,提示JAML过表达的肺腺癌细胞的Wnt/β-catenin通路和PI3K/AKT/mTOR通路活性被过度激活。结论:体内实验证实JAML敲低可抑制肺腺癌移植瘤的生长,抑制肺腺癌细胞的增殖能力;JAML过表达可促进肺腺癌移植瘤的生长,促进肺腺癌细胞的增殖能力。同时证实了 JAML在裸鼠体内可能通过Wnt/β-catenin通路和PI3K/AKT/mTOR通路发挥促癌作用。全文结论1.JAML在肺腺癌中高表达,高表达的JAML与肺腺癌患者进展的临床特征密切相关。2.JAML敲减下调肺腺癌细胞的增殖功能,减弱迁移和侵袭能力,促使细胞周期停滞在G0/G1,细胞凋亡增加;JAML过表达能促进肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,影响细胞周期使S期+G2/M期细胞增加,并抑制细胞凋亡。JAML对肺腺癌的恶性生物学行为起重要调控作用。3.JAML敲减可下调增殖及抑凋亡蛋白的表达,抑制EMT,上调促凋亡蛋白,并使Wnt/β-catenin和PI3K/AKT/mTOR通路部分失活;JAML过表达可上调增殖及抑凋亡蛋白的表达,促进EMT,下调促凋亡蛋白,并使Wnt/β-catenin和PI3K/AKT/mTOR通路过度活化。通路回复实验证实Wnt/β-catenin通路部分参与JAML对肺腺癌细胞系的增殖、迁移、侵袭及EMT表型的影响,PI3K/AKT/mTOR通路部分参与JAML对肺腺癌细胞系的增殖、迁移、侵袭的影响。4.体内实验证实JAML敲减可抑制肺腺癌移植瘤的生长,抑制肺腺癌细胞的增殖能力;JAML过表达可促进肺腺癌移植瘤的生长,促进肺腺癌细胞的增殖能力。同时证实了 JAML在裸鼠体内可能通过Wnt/β-catenin通路和PI3K/AKT/mTOR通路发挥促癌作用。5.JAML在肺腺癌中发挥促癌基因的作用,有望成为肺腺癌新的生物学标志物及有效的治疗靶点。