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目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）以空间学习记忆障碍、神经元丢失以及β淀粉样蛋白（Amyloid beta protein,Aβ）病变为主要特征,其发病机制尚不清楚。近年来高表达的亮氨酸重复蛋白和含免疫球蛋白样结构域的nogo受体相互作用蛋白1（Leucine-rich repeat and immunoglobulin-like domain-containing nogo receptor-intera cting protein 1,LINGO-1）在AD等神经退行性疾病中的作用受到关注,拮抗高表达的LINGO-1不仅对AD动物模型髓鞘损伤具有积极改善作用,还能有效阻止多种神经退行性疾病动物模型中神经元的损伤。然而,高表达的LINGO-1对AD病变中神经元丢失的影响并不清楚。本课题以10月龄的淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein,APP）/早老基因1（Presenilin 1,PS1）双转基因小鼠（处于行为学改变初期）模拟AD的早期阶段,首先通过腹腔注射拮抗剂阻断LINGO-1的作用,研究拮抗LINGO-1对APP/PS1转基因AD小鼠空间学习记忆和工作记忆以及海马内神经元的影响,然后通过海马组织的转录组测序数据分析APP/PS1转基因AD小鼠海马神经元损伤的相关机制通路及其与LI NGO-1的相关性,最后通过双侧大脑海马立体定位注射过表达或沉默海马LINGO-1,探讨海马LINGO-1对正常或AD小鼠认知、神经元相关蛋白以及大麻素1型受体（Cannabinoid type 1 receptor,CB1R）/脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）/酪氨酸激酶受体B（Tyrosine kinase receptor B,TrkB）信号通路的影响;同时以转染APP/PS1双基因的小鼠海马神经元细胞系（HT22细胞）体外模拟AD,探讨体外条件下拮抗LINGO-1对AD海马神经元的作用及作用机制,以期为AD发病机制的研究提供新的科学证据。方法:1.抗LINGO-1抗体对APP/PS1转基因AD小鼠早期认知能力和海马神经元的作用:（1）通过腹腔注射抗LINGO-1抗体以阻断APP/PS1转基因AD小鼠中LINGO-1的作用,采用Morris水迷宫和Y迷宫实验分别评估其空间学习记忆能力及工作记忆能力;分别运用免疫荧光染色和硫黄素S染色标记海马内LINGO-1和Aβ斑块,分析海马内LINGO-1的含量和Aβ斑块的数量;运用尼氏染色和体视学相结合方法分析海马的体积及海马内神经元总数量。（2）在抗LINGO-1抗体干预后的第5周,对各组小鼠给予5-溴脱氧尿苷（5-bromodeoxyuridine,Brd U）腹腔注射以标记增殖细胞;分别用双皮质素（Doublecortin,DCX）免疫组化染色标记未成熟神经元,神经核蛋白（Neuronal nuclei protein,Neu N）免疫组化染色标记成熟神经元,谷氨酸脱羧酶67（Glutamate decarboxylase 67,GAD67）免疫组化染色标记γ-氨基丁酸（Gamma aminobutyric acid,GABA）能中间神经元,运用体视学三维定量方法评估未成熟神经元和GABA能中间神经元的总数量;运用Brd U、DCX和Neu N免疫荧光染色共同标记神经元,并分析新生未成熟神经元（Brd U+/DCX+/Neu N-细胞）、新生成熟神经元（Brd U+/DCX-/Neu N+细胞）、介于未成熟和成熟神经元之间的第三类新生神经元（Brd U+/DCX+/Neu N+细胞）以及总的新生神经元（前三者之和）的密度;运用GAD67、八肽胆囊收缩素（Chol ecystokinin octapeptide,CCK8）和CB1R免疫荧光染色共同标记GA BA能中间神经元,并分析表达CB1R的GABA能中间神经元（即GA D67+/CB1R+细胞）、表达CB1R的CCK-GABA能中间神经元（GAD67+/CCK8+/CB1R+细胞）的密度;运用GAD67、LINGO-1和CB1R免疫荧光染色共同标记表达CB1R的GABA（CB1R-GABA）能中间神经元,并分析能够表达LINGO-1的CB1R-GABA能中间神经元（GAD67+/LI NGO-1+/CB1R+细胞）和不表达LINGO-1的CB1R-GABA能中间神经元（GAD67+/LINGO-1-/CB1R+细胞）的密度以及表达LINGO-1的CB1R-GABA能中间神经元占总的CB1R-GABA能中间神经元的密度比（即GAD67+/LINGO-1+/CB1R+细胞与GAD67+/CB1R+细胞的密度比值）。2.LINGO-1对正常小鼠和APP/PS1转基因AD小鼠海马神经元作用的机制研究:（1）运用转录组测序分析正常野生型（Wild type,WT）小鼠和APP/PS1转基因AD小鼠的海马组织内RNA的表达,分别经GO-P-Desc和GO-C-Desc分析与神经元相关的差异表达基因。（2）通过双侧大脑海马立体定位注射过表达LINGO-1的腺相关病毒（Adeno associated virus,AAV）过表达正常小鼠海马内的LINGO-1,然后运用Morris水迷宫实验和Western blot方法检测其空间学习记忆能力和LINGO-1蛋白、海马内神经元相关蛋白,如GAD67、DCX和Neu N,以及CB1R蛋白与BDNF/TrkB/磷酸化酪氨酸激酶受体B（Phosphorylated tyrosine kinase receptor B,p-TrkB）信号通路中的蛋白表达情况。（3）通过双侧大脑海马立体定位注射沉默LINGO-1的AAV拮抗AD小鼠海马内的LINGO-1,然后运用Morris水迷宫实验和Western blot技术评估其空间学习记忆能力和LINGO-1蛋白、海马内神经元相关蛋白,如GAD67、DCX和Neu N,以及CB1R蛋白与BDNF/TrkB/p-TrkB信号通路中的蛋白表达情况。（4）对体外培养的经APP/PS1转染的HT22细胞,给予抗LINGO-1抗体干预后,先运用Western blot实验评估细胞内LINGO-1蛋白、神经元相关蛋白,如GAD67、DCX和Neu N,以及CB1R蛋白与BDNF/TrkB/p-TrkB信号通路中的蛋白表达情况,再运用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,Edu）标记增殖细胞,最后运用免疫荧光染色评估细胞内LINGO-1与Aβ的表达情况、新生神经元（Edu+/DCX+/Neu N-细胞、Edu+/DCX-/Neu N+细胞、Edu+/DCX+/Neu N+细胞）的表达情况、富含CB1R的CCK-GABA能中间神经元的表达情况、表达LINGO-1的CB1R-GABA能中间神经元占总的CB1R-GABA能中间神经元的比值以及GABA能中间神经元上TrkB与p-TrkB的表达情况。（5）对体外培养的的经APP/PS1转染的HT22细胞,给予CB1R拮抗剂1-（2,4-二氯苯基）-5-（4-碘苯基）-4-甲基-N-1-哌啶基-1H-吡唑-3-甲酰胺（1-（2,4-dichlorophenyl）-5-（4-iodophenyl）-4-methyl-n-1-pip eridyl-1h-pyrazole-3-formamide,AM251）和激活剂花生四烯基-2’-氯乙酰胺水合物（Arachidonyl-2’-chloroethylamide hydrate,ACEA）干预后,运用Western blot实验评估细胞内LINGO-1蛋白、神经元相关蛋白,如GAD67、DCX和Neu N,以及CB1R蛋白与BDNF/TrkB/p-TrkB信号通路中的蛋白表达情况,并用免疫荧光染色检测AM251和ACEA对细胞内LINGO-1与TrkB表达比率的影响。结果:1.抗LINGO-1抗体对APP/PS1转基因AD小鼠早期行为学以及包括海马神经元在内的神经病理学的作用:（1）经腹腔注射抗LINGO-1抗体以拮抗LINGO-1能有效改善APP/PS1转基因AD小鼠的空间学习记忆及工作记忆能力,降低海马LINGO-1蛋白的荧光强度,减少海马Aβ斑块的密度,延缓海马体积的萎缩,延缓海马齿状回（Dentate gyrus,DG）区未成熟神经元及海马DG区和CA1区总的神经元、GABA能中间神经元数量的丢失。（2）经腹腔注射抗LINGO-1抗体以拮抗LINGO-1能有效促进海马DG区包括Brd U+/DCX+/Neu N-细胞、Brd U+/DCX-/Neu N+细胞、Brd U+/DCX+/Neu N+细胞在内的三类新生神经元的形成,增加海马各亚区（DG区、CA1区、CA2/3区）富含CB1R的CCK-GABA能中间神经元的数量,并显著降低海马DG区和CA1区CB1R-GABA能中间神经元上LINGO-1的表达。2.LINGO-1对正常小鼠和APP/PS1转基因AD小鼠海马神经元的作用机制:（1）差异分析显示APP/PS1转基因AD小鼠和正常WT小鼠海马内有3510个差异表达的基因;经GO-P-Desc分析,发现这3510个差异表达的基因中有418个与神经元相关,其中就包括LINGO-1与DCX基因。经线性相关性分析后显示:LINGO-1与DCX基因表达存在负相关关系。再经GO-C-Desc和统计分析,发现APP/PS1小鼠海马内的可编码GAD67蛋白的GAD1基因和NTRK2基因（即TrkB基因）表达均降低。（2）过表达海马LINGO-1后,正常小鼠海马内LINGO-1蛋白水平显著性增高,虽然小鼠的空间学习记忆能力存在部分受损,CB1R蛋白水平降低,但是其海马神经元相关蛋白（GAD67、DCX、Neu N）及BDNF/TrkB/p-TrkB信号通路的蛋白水平并未发生改变。（3）沉默海马LINGO-1后,AD小鼠海马内LINGO-1蛋白水平显著性降低,其空间学习记忆能力得到明显的改善,其神经元相关蛋白中仅DCX蛋白水平升高,GAD67和Neu N蛋白水平未发生改变,此外,CB1R、BDNF和p-TrkB蛋白水平升高,但TrkB蛋白水平未发生改变。（4）抗LINGO-1抗体干预后,经APP/PS1转染的HT22细胞内的LINGO-1蛋白水平降低,Neu N、CB1R、TrkB和p-TrkB蛋白水平升高,GAD67、DCX、BDNF蛋白水平未发生改变。此外,LINGO-1+细胞、Aβ+细胞和LINGO-1+/Aβ+细胞均减少,Edu+/DCX+/Neu N+细胞和总的新生神经元数量（Edu+/DCX+/Neu N-细胞、Edu+/DCX-/Neu N+细胞和Edu+/DCX+/Neu N+细胞三类细胞的总和）显著性增加,富含CB1R的CCK-GABA能中间神经元显著性增加,表达LINGO-1的CB1R-GA BA能中间神经元占总的CB1R-GABA能中间神经元的比值显著性降低,DAPI/GAD67+/TrkB+细胞数量、DAPI/GAD67+/p-TrkB+细胞数量和DAPI/GAD67+/TrkB+/p-TrkB+细胞的数量显著性增加。（5）对于经APP/PS1转染的HT22细胞,激活CB1R能显著地升高其细胞内的CB1R、GAD67、DCX、Neu N、BDNF、TrkB和p-TrkB蛋白水平,降低其细胞内LINGO-1的蛋白水平和LINGO-1与TrkB的比率;相反,拮抗CB1R不能显著影响其细胞内的TrkB蛋白水平,但能显著地降低其细胞内的CB1R、GAD67、DCX、Neu N、BDNF和p-TrkB蛋白水平,升高其细胞内LINGO-1的蛋白水平和LINGO-1与TrkB的比率。此外,LINGO-1拮抗剂具有与CB1R激活剂相同的作用,同时,拮抗LINGO-1能够显著逆转CB1R拮抗剂AM251引起的一系列改变。结论:1.无论是通过腹腔注射抗LINGO-1抗体拮抗海马内LINGO-1还是通过脑立体定位注射特异性沉默海马内LINGO-1,均能够有效改善转基因AD小鼠海马依赖的空间学习和记忆能力,保护海马神经元。2.拮抗LINGO-1能显著增加AD小鼠海马内新生神经元的形成和成熟,在降低CB1R-GABA能中间神经元上LINGO-1表达的同时提高海马内CB1R-GABA能中间神经元的密度,提示CB1R-GABA能中间神经元可能是LINGO-1调控转基因AD小鼠海马神经发生的关键靶细胞。3.过表达正常小鼠海马内LINGO-1对其海马CB1R-GABA能中间神经元下游CB1R/BDNF/TrkB信号通路没有显著影响,而沉默AD小鼠海马内LINGO-1则能显著增强其海马CB1R-GABA能中间神经元下游CB1R/BDNF/TrkB信号通路。4.经动物和细胞实验验证,拮抗LINGO-1可通过激活CB1R/BDNF/TrkB信号通路有效改善AD小鼠海马相关行为学能力,并改善AD小鼠海马和经APP/PS1转染的HT22细胞内神经元相关蛋白的表达。本研究结果可望为进一步探讨LINGO-1作用机制提供科学依据。