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可传播性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)又称为朊病毒病(prion diseases),是一类广泛存在于人类和多种动物中的致死性神经系统退行性疾病,如人的克雅病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、GSS综合症(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, GSS)、Kuru病、家族性致死性失眠症(fatal familial insomnia, FFI),绵羊和山羊的瘙痒病(scrapie),疯牛病、鹿的慢性消耗性疾病及其他动物的海绵状脑病等。基于PrPC在发病中的重要作用,目前治疗研究的策略之一是降低机体正常蛋白PrPC的水平,减少朊病毒的复制,延长生命。RNAi是高度保守,针对特定序列转录后的基因沉默机制,借助小干扰RNA (siRNA)来降解同源mRNA。目前RNAi在几种神经退行性疾病的动物模型中已经表现出治疗的潜力,而应用于疾病治疗的重要环节是dsRNA在体内的表达。我们根据人PrP已知序列结合干扰质粒载体的特性,选择构建了针对108-114(Ri2)及171-177(Ri3)两个位点的干扰细胞中PrP及其突变体表达的重组siRNA质粒。经Western blot检验Ri2与Ri3能够有效降低293T细胞中转染质粒表达的全长PrP,及人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y中内源性表达的PrP。PG9和PG12分别为家族性克雅病相关PrP突变体中4个和7个额外八肽重复插入的突变体。在293T细胞中,Ri2和Ri3也能够明显减少转染的PG9和PG12蛋白表达水平。MTT实验表明,利用Ri2或Ri3敲低野生型PrP的表达水平对细胞的生存率没有明显影响,但能够显著降低细胞抵抗Cu2+的细胞毒性作用；而Ri2或Ri3可明显拮抗PrP突变体PG9、PG12对细胞的毒性作用,这种拮抗作用呈明显的时间相关性特征,即干扰质粒越早转染越能明显抵抗细胞毒性作用,提高细胞的生存率。研究表明具有神经细胞毒性的CytoPrP能够结合微管蛋白,并抑制微管的聚合,导致有丝分裂障碍以及细胞凋亡。PG9、PG12与CytoPrP同样在细胞胞浆分布且具有细胞毒性,因此PG9、PG12也可能与微管蛋白相互影响。Western blot检测细胞微管蛋白水平在有外源性PG9和PG12表达时明显下降,共转染PrP干扰质粒Ri3后能够使细胞微管蛋白表达水平得以恢复。Ri3质粒滞后转染12h仍然能够提高微管蛋白的表达,而滞后转染24h则观察不到微管蛋白表达水平的恢复,激光共聚焦实验表明转染PG9、PG12能抑制细胞内微管结构的形成,而在Ri3滞后12h转染细胞后,微管的结构同样有明显的恢复。上述结果显示越早转染RNAi干扰质粒越能及时恢复微管蛋白的表达。