研究背景原发性肝癌发生率在肿瘤中排第六,肿瘤相关死亡率中排第四,原发性肝癌中大部分的类型是肝细胞肝癌（HCC）。肝癌患者的急剧增加以及临床上肝癌患者的复发已经产生世界范围内的大流行。迄今为止,很少有有效的化疗药物治疗这种高度恶性的肿瘤,尤其是近年来肝癌细胞对化疗和放射治疗产生抵抗,肝癌给全世界都带来巨大的健康以及经济的负担。虽然5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）是治疗晚期HCC的首选药物之一,但它同样也存在各种获得性和内在性药物抵抗。褪黑素（melatonin,MLT）主要由人的松果体分泌,进入人体循环,有调节昼夜节律的活性。过去二十年中,越来越多的学者发现褪黑素的多功能潜能,如抗炎、抗肿瘤、抗氧化活性、内分泌节律调节作用等。在文献中报道褪黑素通过抗增殖和促凋亡作用显示出抗肿瘤作用。此外,据报道,褪黑素联合化疗药物可增强该种化疗诱导的细胞凋亡。大量临床样本和体外研究的数据表明,异常激活的PI3K/AKT通路与肿瘤的5-FU药物化疗耐药相关,而褪黑素与该通路亦具有相关性;此外该通路的抑制剂与5-FU共同作用在肝癌的治疗中具有协同作用。在我们之前的研究中,褪黑素也被发现可以增加阿霉素在肝癌细胞中的敏感性。这些研究证据提示我们褪黑素可能会增强肝癌细胞对5-FU的敏感性,将会为晚期HCC患者带来巨大的益处。肝细胞肝癌通常对抗肿瘤药物不敏感,肝细胞肝癌患者应用化疗药物治疗会迅速出现获得性耐药。多药耐药（MDR）是一种现象,是指暴露于一种药物的细胞对具有不同结构和功能的其他药物交叉耐药的现象。MDR的主要机制之一是肿瘤细胞主动泵出化疗药物的能力增强,导致细胞内化疗药物积累量低于有效水平剂量。P-糖蛋白（P-gp）隶属于ATP结合盒（ABC）蛋白超家族,并且是MDR表型中最具有代表性的分子,是介导MDR的最典型的外排泵之一。P-gp抑制剂可通过抑制细胞内药物泵出以增加细胞内药物积累浓度,从而改善细胞对化疗药物的反应并改善患者的预后。尽管在早期研究中取得了一些成功,但大多数包括P-gp抑制剂的临床试验,甚至是第三代抑制剂的临床试验,都没有证实其临床效益。考虑到化疗耐药性对肝癌的进展至关重要,因此寻找能够替代P-gp抑制剂的药物是重要且紧迫的。目的通过将5-FU、褪黑素以及5-FU联合褪黑素作用于BEL-7402/5-FU细胞,观察褪黑素是否具有逆转5-FU耐药的作用,了解褪黑素对人肝癌细胞增殖、凋亡以及P-gp表达的影响以及可能的机制。通过对PI3K/AKT信号途径的研究,进一步探讨褪黑素逆转BEL-7402/5-FU肝癌细胞5-FU抵抗性的可能的机制。方法（1）使用12个浓度梯度的（0-3200 ug/ml）的5-FU作用于人肝癌细胞BEL-7402以及人耐药肝癌细胞BEL-7402/5-FU细胞,MTT法检测各个浓度对细胞的抑制率,计算用5-FU化疗药物处理的两种肝癌细胞的IC₅₀值和耐药指数,明确BEL-7402/5-FU细胞是否对5-FU存在耐药性;Western-Blot法检测两种细胞PI3K/AKT通路主要蛋白以及P-gp的表达情况。（2）8个浓度（0-2mM）的褪黑素作用于BEL-7402/5-FU细胞以及人正常肝细胞L02,MTT法检测其对细胞的抑制率,并筛选出褪黑素的无毒剂量用于后续研究。（3）BEL-7402/5-FU细胞与褪黑素、5-FU单药或联合培养48h后,MTT法计算IC₅₀、逆转倍数;FCS检测各组细胞凋亡率的高低;克隆形成实验检测细胞增殖;Western-Blot法检测PI3K/AKT通路主要蛋白以及P-gp的表达情况。（4）BEL-7402/5-FU细胞分别与褪黑素,5-FU,5-FU联合褪黑素或5-FU联合维拉帕米作用48h后,ICC法观察分析细胞内P-gp的表达变化情况;流式细胞仪检测Rh123外排情况。（5）加入PI3K蛋白抑制剂LY294002,流式细胞仪检测5-FU,褪黑素、5-FU联合褪黑素或褪黑素、5-FU联合LY294002对细胞凋亡率的影响;Western-Blot法检测PI3K/AKT通路蛋白以及P-gp的表达情况。结果（1）MTT实验显示BEL-7402/5-FU的耐药性是BEL-7402的280倍。Western-Blot实验显示BEL-7402/5-FU细胞P-gp以及PI3K/AKT通路的主要蛋白高表达。（2）随着时间和剂量的增加,褪黑素对肝癌耐药BEL-7402/5-FU细胞的抑制不断加强;MTT法计算出褪黑素对正常肝细胞L02的IC₁₀值为0.84mM,小于该剂量即为无毒剂量。（3）5-FU单独作用于BEL-7402/5-FU细胞的IC₅₀值为1455.59 ug/mL,与褪黑素（0.5mM）联合使用时其IC₅₀值为328.23 ug/mL,逆转倍数为4.33倍。（4）褪黑素联合5-FU作用于BEL-7402/5-FU细胞,可显著增加5-FU诱导的凋亡;减少克隆形成;Western-Blot显示5-FU处理细胞后会显著增加P-gp、PI3K、p-AKT的表达,而褪黑素加入后可以中和这种增加,降低其表达。（5）PI3K抑制剂LY294002使用后,FCS检测结果表明,添加抑制剂后可以进一步地提高细胞凋亡率,降低P-gp、PI3K、p-AKT表达水平以及增强PTEN蛋白的表达。结论（1）BEL-7402/5-FU细胞是研究P-gp介导的肝细胞肝癌5-FU耐药的较为合适的细胞系。（2）褪黑素（0.5mM）可以逆转BEL-7402/5-FU肝癌细胞对5-FU的抵抗性。（3）褪黑素联合5-FU可以增加BEL-7402/5-FU细胞的凋亡率,减少其克隆形成能力。（4）褪黑素通过抑制PI3K/AKT途径,从而逆转P-gp介导的BEL-7402/5-FU细胞5-FU耐药。