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目的:通过观察硼替佐米(Bortezomib)对人肾小管上皮细胞(HK-2)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的smad泛素化调节因子2(Smurf2)表达及肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)作用的影响,明确Bortezomib对肾小管上皮细胞EMT形成的影响并探讨相关分子机制。方法:以HK-2细胞为研究对象,将细胞随机分为四组:对照组(不完全培养基处理)、TNF-α组(TNF-α处理)、Bortezomib组(Bortezomib处理)及实验组(Bortezomib和TNF-α共处理),各组细胞经相应药物处理,收集细胞。分别采用实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测纤连蛋白(Fibronectin,FN)、Smurf2、上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)及α平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的mRNA和蛋白表达;在倒置显微镜下观察各组细胞形态的变化;运用细胞划痕实验、侵袭实验观察各组细胞迁移及侵袭能力的变化。此外,我们还以TNF-α刺激HK-2细胞0~24h后,用Western blot方法检测不同的细胞内信号通路相应的关键介质磷酸化水平,以明确在HK-2细胞中TNF-α可以激活的细胞内信号通路。然后,以上述可激活的细胞内信号通路特异性的抑制剂预处理HK-2细胞,再分别予以Bortezomib和/或TNF-α刺激细胞24~48h,以探究Bortezomib发挥其干预作用的相关分子机制。结果:1、与对照组相比,TNF-α处理可使HK-2细胞中FN的mRNA和蛋白表达水平明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);与单纯TNF-α处理组相比,加入硼替佐米共刺激可抑制TNF-α诱导的FN mRNA和蛋白水平增高(P<0.05);而硼替佐米单独处理组与对照组相比,两组细胞中FN的表达差异没有统计学意义(P>0.05)。2、与对照组相比,TNF-α处理后可致HK-2细胞中E-cadherin明显降低,α-SMA明显增高(P<0.05);与TNF-α组相比,加入硼替佐米共刺激后,可逆转TNF-α介导的E-cadherin和α-SMA表达变化(P<0.05);而硼替佐米单独处理组与对照组相比,两组细胞中E-cadherin和α-SMA的表达没有明显变化(P>0.05)。3、倒置显微镜观察结果显示:正常HK-2细胞表现为椭圆形的鹅卵石样,TNF-α处理后,细胞形态转变为梭形的成纤维细胞样;但加入硼替佐米与TNF-α共刺激后,与TNF-α单纯处理组相比,共刺激组细胞形态仍呈鹅卵石样;但硼替佐米单独处理组与对照组相比,细胞形态并没有发生明显变化。4、细胞划痕实验与侵袭实验结果表明:与对照组相比,TNF-α处理后可致HK-2细胞的迁移和侵袭能力显著增强(P<0.05);而与TNF-α单纯处理组相比,加入Bortezomib共刺激后,可明显逆转HK-2细胞的迁移侵袭能力增强(P<0.05);而Bortezomib单独处理组与对照组相比,细胞迁移和侵袭能力没有明显变化(P>0.05)。5、与对照组相比,TNF-α处理可引起Smurf2 mRNA和蛋白表达水平明显增高(P<0.05);加入硼替佐米后则可抑制TNF-α诱导的Smurf2增高(P<0.05);而硼替佐米单独处理组与对照组相比,Smurf2的表达水平没有明显变化(P>0.05)。6、与对照组相比,TNF-α处理可激活Akt/mTOR/p70s6k通路,磷酸化水平增高(P<0.05);加入Bortezomib共刺激后可抑制TNF-α激活的Akt/mTOR/p70S6k通路关键介质的磷酸化水平(P<0.05);而Bortezomib单独处理组与对照组相比,通路无显著变化。与TNF-α组相比,加入Bortezomib或Akt通路抑制剂MK2206共刺激,两者皆可抑制TNF-α诱导的Akt/mTOR/p70S6k通路关键介质的磷酸化水平、FN、E-cadherin、α-SMA及Smurf2的表达变化(P<0.05),但是二者的抑制程度没有差异(P>0.05);而MK2206单独处理组与对照组相比,结果没有显著差异。结论:在HK-2细胞中,Bortezomib可能通过抑制Akt/mTOR/p70S6k通路活性进而下调TNF-α诱导的Smurf2表达,从而部分逆转TNF-α诱导的肾小管EMT形成作用。